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閱讀：16675發(fā)布時(shí)間：2017-11-1
HE染色的實(shí)驗(yàn)原理方法及注意事項(xiàng)
HE染色全名為蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色方法，是zui基本的也是zui重要的病理學(xué)染色技術(shù)。
HE染色是目前國內(nèi)外病理診斷上廣泛采用的 常規(guī)染色方法。一張好的HE切片是保證正確病理診斷的關(guān)鍵。切片質(zhì)量的好壞，可直接影響疾病診斷的及時(shí)與準(zhǔn)確性。作為一個(gè)合格的實(shí)驗(yàn)技術(shù)員，能制作出一張高質(zhì)量的HE染色切片，是必須掌握的一門重要功課。
HE染色的實(shí)驗(yàn)原理及注意事項(xiàng)
一、細(xì)胞核染色原理：
蘇木精為堿性天然染料，可使細(xì)胞核著色。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側(cè)帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。
二、細(xì)胞漿染色原理：
細(xì)胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，為兩性化合物、細(xì)胞漿的染色與pH值有密切關(guān)系，當(dāng)pH調(diào)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)4.7-5.0時(shí)，胞漿對(duì)外不顯電性，此時(shí)酸或堿性染料不易染色。當(dāng)pH調(diào)到6.7-6.8時(shí)，大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pH值，表現(xiàn)酸性電離，而帶負(fù)電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現(xiàn)時(shí)胞核也被染色，核和胞漿難以區(qū)分。因此必須把pH調(diào)至胞漿等電點(diǎn)以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負(fù)電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細(xì)胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明的對(duì)比。
三、分化作用：
染色后，用某些特定的溶液將組織過多結(jié)合的染色劑脫去，這個(gè)過程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結(jié)構(gòu)，使組織與色素分離而褪色。經(jīng)蘇木精染色后，必須用0.5%鹽酸乙醇分化，使細(xì)胞核過多結(jié)合的蘇木精染料和細(xì)胞漿吸附的蘇木精染料脫去，在進(jìn)行伊紅染色，才能保證細(xì)胞核與細(xì)胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關(guān)鍵的一步。
四、返藍(lán)作用：
分化之后，蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，呈紅色，在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài)，呈藍(lán)色。組織切片經(jīng)0.5%鹽酸乙醇分化后呈紅色或粉紅色，故分化之后，立即用水除去組織切片上的酸而終止分化，再用弱堿性水（0.2%氨水）使蘇木精染上的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，這個(gè)過程稱為返藍(lán)作用或藍(lán)化作用。另外用自來水浸洗也可使細(xì)胞核返藍(lán)，但所需時(shí)間較長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)材料
固定液：常用95%乙醇和冰丙酮
蘇木精染液：稱取蘇木精粉0.5g，銨礬24g溶解于70ml蒸餾水中，然后取NaIO 31g 5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均勻，濾紙過濾，備用。
伊紅染液：稱取0.5g溶性伊紅染液，溶于100ml蒸餾水中。
稀鹽酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1%鹽酸。
系列濃度的乙醇、二甲苯、中性樹膠。
培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、眼科鑷、蓋玻片、載玻片、顯微鏡。
實(shí)驗(yàn)步驟
樣品制備：對(duì)于貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度約1×105/ml，滴加于蓋玻片上(置于6孔板中)，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，取出細(xì)胞爬片，用PBS 洗滌3次。
樣品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次1min。
染核：蘇木素染液染色2-3min，自來水洗滌。
分色：鏡下觀察，若細(xì)胞核染色過深，用1%鹽酸酒精溶液分色數(shù)秒，自來水洗滌。
染胞質(zhì)：浸入伊紅染液染色1min，自來水洗滌。
吹干或自然晾干細(xì)胞 爬片后，中性樹膠封片。
若細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，則染色時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，蘇木素染色12-15min，伊紅5min即可。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果及注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)，肌纖維，膠原纖維和紅細(xì)胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細(xì)菌可呈藍(lán)色或紫藍(lán)色
注意事項(xiàng)：
1. 染色時(shí)調(diào)節(jié)pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時(shí)間長(zhǎng)，組織酸化而影響細(xì)胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時(shí)間長(zhǎng)一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細(xì)胞核著色較深。染伊紅時(shí)胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。
2. 切片染蘇木精后，分色這一步是關(guān)鍵，應(yīng)在顯微鏡下控制進(jìn)行，一般以細(xì)胞核染色清楚（晰）而細(xì)胞質(zhì)基本無色為佳。如果過分延長(zhǎng)分色時(shí)間將導(dǎo)致染色太淺，應(yīng)重新染色后再行分色。
3. 切片經(jīng)酒精脫水后，入二甲苯時(shí)可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài)，此為脫水不*，應(yīng)將切片退回*，更換酒精、二甲苯，以求*脫水與透明。
4. 在染色過程中不要讓切片干燥，以免切片收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。
5. 切片從二甲苯取出或進(jìn)入二甲苯前，切片周邊均應(yīng)擦干凈或吸干多余水分。
6. zui后封固時(shí)，要用中性樹脂，防止日后褪色，蓋片要選大于組織塊的面積，如漏出一部分不久將會(huì)褪色，所用樹脂濃度要適當(dāng)，樹脂封固時(shí)不能有氣泡。
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