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閱讀：428發(fā)布時(shí)間：2017-7-27
二聚體蛋白熒光標(biāo)記應(yīng)用單分子FRET研究獲進(jìn)展
英國(guó)*化學(xué)會(huì)主辦刊物Chemical Communications（ChemComm）以封面論文（Inside Front Cover）的形式在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所柯莎（Sarah Perrett）研究組題為A Co-expression Strategy to Achieve Labeling of Individual Subunits within a Dimeric Protein for Single Molecule Analysis的文章，論文報(bào)道了一種基于共表達(dá)的方式獲得異二聚體蛋白，以實(shí)現(xiàn)對(duì)二體蛋白中某一單體上進(jìn)行位點(diǎn)特異性熒光標(biāo)記的方法，該方法可應(yīng)用于二聚體蛋白構(gòu)象及動(dòng)力學(xué)機(jī)制的單分子FRET研究。
單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）是研究生物大分子的構(gòu)象及動(dòng)力學(xué)機(jī)制的重要方法，尤其對(duì)于結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段不易解析的無(wú)序蛋白（intrinsically disordered protein），單分子FRET技術(shù)可通過(guò)測(cè)量標(biāo)記的熒光供體與受體染料對(duì)之間的距離，分析無(wú)序蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象信息。單分子FRET研究首先需要在目標(biāo)蛋白特定位點(diǎn)標(biāo)記熒光分子，目前廣泛使用的標(biāo)記方法是引入半胱氨酸殘基定點(diǎn)突變?cè)倥c馬來(lái)酰亞胺官能化染料進(jìn)行共價(jià)反應(yīng)。上述方法僅適用于單體蛋白，而生物體中許多蛋白質(zhì)均以二聚或寡聚狀態(tài)存在及行使功能，對(duì)于這些蛋白難以通過(guò)傳統(tǒng)的半胱氨酸標(biāo)記方法對(duì)其進(jìn)行單一FRET染料對(duì)的位點(diǎn)特異性標(biāo)記。在以往的研究中，對(duì)于二聚體蛋白多采用亞基交換獲得異二聚體，或截?cái)喽垠w作用界面的結(jié)構(gòu)域使之形成單體再進(jìn)行單分子FRET實(shí)驗(yàn)，但這些方法有明顯的局限性。
本研究提出了一個(gè)共表達(dá)的策略，即利用pQLink載體同時(shí)表達(dá)野生型及突變型的蛋白，獲得由一個(gè)無(wú)標(biāo)記單體與一個(gè)特異性標(biāo)記FRET染料對(duì)的單體組成的異二聚體。文章以釀酒酵母prion蛋白Ure2（其天然態(tài)以穩(wěn)定二聚體形式存在）為例，基于上述標(biāo)記策略將FRET染料對(duì)分別標(biāo)記于Ure2 N端prion無(wú)序結(jié)構(gòu)域以及C端球形功能結(jié)構(gòu)域，采用單分子FRET技術(shù)確定了N端結(jié)構(gòu)域相對(duì)于C端結(jié)構(gòu)域的空間位置及其發(fā)生相互作用的區(qū)域。這種新的標(biāo)記方法克服了經(jīng)典的半胱氨酸標(biāo)記二聚體蛋白質(zhì)的局限性，且具有普適性，使單分子FRET技術(shù)可擴(kuò)展研究具有重要生物學(xué)功能的二聚體蛋白。
生物物理所研究員柯莎和副研究員吳思為本文的共同通訊作者，柯莎課題組的博士生婁飛為本文的*作者，博士生楊潔為參與者。該研究得到了科技部973計(jì)劃、自然科學(xué)基金委項(xiàng)目等的資助。
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