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閱讀：5485發(fā)布時(shí)間：2017-10-23
細(xì)胞培養(yǎng)是常見(jiàn)的生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，與之相關(guān)的操作包括細(xì)胞換液、傳代、凍存、復(fù)蘇、計(jì)數(shù)等，會(huì)涉及很多技術(shù)上的細(xì)節(jié)，尤其對(duì)于較為敏感的細(xì)胞，更應(yīng)注意每一步的操作。
小威特別結(jié)合日常實(shí)驗(yàn)操作和國(guó)外文獻(xiàn)資料，收集一些關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的常見(jiàn)問(wèn)題和解答，方便細(xì)胞培養(yǎng)人員參考：
1、如果收到一管干冰運(yùn)過(guò)來(lái)的細(xì)胞，能直接把它放到液氮中保存嗎？
答：在很多情況下，干冰（-80°C）運(yùn)輸?shù)募?xì)胞可以放回液氮，之后再進(jìn)行快速解凍。然而，這樣處理后可能降低細(xì)胞活力。對(duì)于一些敏感的細(xì)胞系，這可能使細(xì)胞復(fù)蘇更加困難。這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由于溫度變化導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)冰晶結(jié)構(gòu)的改變。因此，建議細(xì)胞在收到后應(yīng)盡快解凍和培養(yǎng)。減少在-80°C的儲(chǔ)存時(shí)間，這種溫度只用于運(yùn)輸。
2、從液氮中取出細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，應(yīng)采取哪些安全措施？
答：在液氮中的細(xì)胞凍存管如果沒(méi)有*密封，有液氮漏入，解凍時(shí)凍存管的氣溫急劇上升，可能會(huì)導(dǎo)致爆炸。因此，當(dāng)從液氮中取出細(xì)胞時(shí)，建議佩戴護(hù)目鏡和防護(hù)手套。復(fù)蘇時(shí)，應(yīng)將凍存管在37°C水浴中不斷搖動(dòng)，在1-2分鐘內(nèi)使凍存液*融化。
之后用酒精棉球擦拭凍存管外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到已加入10ml培養(yǎng)液的離心管內(nèi)，1000 rpm下離心5～10分鐘，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，置 5% CO2孵箱靜置培養(yǎng)。
3、為什么應(yīng)將細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮罐中的氣相而非液相？
答：細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮?dú)庀嘀懈菀讖?fù)蘇。而在液氮的液相中，如果凍存管沒(méi)有正確密封或有泄漏，細(xì)胞與液氮直接接觸，會(huì)使細(xì)胞解凍后活力受到影響。
4、對(duì)于懸浮細(xì)胞，如何更換培養(yǎng)基？
答：培養(yǎng)懸浮細(xì)胞可以只是簡(jiǎn)單地添加新鮮培養(yǎng)基（如果空間允許）或者通過(guò)離心（100×g 5分鐘）從舊培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，隨后將沉淀的細(xì)胞再懸浮于新鮮培養(yǎng)基中。
然而，對(duì)于大多數(shù)懸浮細(xì)胞系，簡(jiǎn)單添加培養(yǎng)基是更好的方法。無(wú)論哪種方法，都需要細(xì)胞達(dá)到其zui大飽和密度之前更新培養(yǎng)基。細(xì)胞的飽和密度在3×10 5至2×10 6之間，具體依賴于細(xì)胞系和培養(yǎng)條件（靜置或攪動(dòng)、氧合水平等）。
細(xì)胞必須稀釋至較低的細(xì)胞濃度以允許足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)恢復(fù)，使細(xì)胞保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。假如只是簡(jiǎn)單地更換培養(yǎng)基而不降低細(xì)胞密度，細(xì)胞就會(huì)迅速耗竭培養(yǎng)基并死亡。
如果細(xì)胞被稀釋到其zui小密度之下，則會(huì)進(jìn)入滯后期，生長(zhǎng)非常緩慢，或者會(huì)死亡。每種懸浮細(xì)胞系的飽和密度和傳代間隔都不一樣，因此，每日細(xì)胞計(jì)數(shù)是監(jiān)測(cè)懸浮細(xì)胞系的方式。
5、細(xì)胞培養(yǎng)推薦的CO2水平是多少？
答：盡管細(xì)胞培養(yǎng)體系中的CO2水平范圍為0.03％~40%（通常大氣中的CO2約0.03％），但zui常見(jiàn)的在空氣中不添加CO2或者CO2濃度為5％~10％。
調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中*的濃度以與氣相中CO2水平達(dá)到平衡非常重要。細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生CO2，同時(shí)需要少量的碳酸用于生長(zhǎng)和存活。如果不添加CO2并且細(xì)胞大量繁殖，則可以使用4mM（0.34g / L）的無(wú)水*。
然而，這時(shí)培養(yǎng)瓶蓋子應(yīng)擰緊。如果培養(yǎng)體系需要5％或10％的CO2，則在37℃下分別使用23.5mM（1.97g / L）或47mM（3.95g / L）*，初始pH為約7.6。在這些條件下，應(yīng)使培養(yǎng)瓶松蓋或使用培養(yǎng)皿來(lái)保持氣體平衡。
6、為什么一些細(xì)胞需要丙酮酸鈉？我應(yīng)加多少丙酮酸鈉到培養(yǎng)基中？
答：丙酮酸鹽是糖酵解途徑中的*個(gè)容易進(jìn)出細(xì)胞的有機(jī)酸代謝物。 因此，培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉能同時(shí)為合成代謝提供能量源和碳源，有助于維持某些特定的細(xì)胞，有助于細(xì)胞克隆或者在培養(yǎng)基中血清濃度降低時(shí)需要。丙酮酸鈉還有助于降低熒光引發(fā)的細(xì)胞毒性。通常加入的丙酮酸鈉終濃度為1mM。商品化的丙酮酸鈉溶液通常為100mM儲(chǔ)存液（100X）。
圖 糖酵解途徑
7、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿中的細(xì)胞密度是多少？
請(qǐng)參考如下數(shù)據(jù)：
細(xì)胞產(chǎn)量根據(jù)細(xì)胞密度1 x 106 cells/ cm2進(jìn)行的估算。
細(xì)胞產(chǎn)量根據(jù)細(xì)胞密度1 x 105 cells/ cm2進(jìn)行的估算。
多孔板中細(xì)胞的接種密度：
成像時(shí)密度通常為7500-20000個(gè)細(xì)胞/孔（96孔板）和1000-4000個(gè)細(xì)胞/孔（384孔板）。 細(xì)胞密度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致自動(dòng)對(duì)焦困難，特別是如果細(xì)胞長(zhǎng)滿，并且擠在一起，通常會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞位于焦點(diǎn)之外。細(xì)胞密度過(guò)低，導(dǎo)致許多空白區(qū)域和焦點(diǎn)損失，特別是在使用較高放大倍數(shù)時(shí)。接種密度可以通過(guò)在培養(yǎng)板上接種不同稀釋濃度的細(xì)胞，并使其在實(shí)驗(yàn)條件下生長(zhǎng)（可以促進(jìn)或阻止生長(zhǎng)）來(lái)評(píng)估。
圖 細(xì)胞密度較高時(shí)妨礙成像
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