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技術(shù)文章

細(xì)胞狀態(tài)不好,你排除過支原體嗎?

閱讀:803發(fā)布時(shí)間:2017-10-19

當(dāng)我們?cè)陴B(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候,有可能會(huì)出現(xiàn)如下的狀況:

  • 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢
  • 細(xì)胞變形
  • 碎片增加
  • 懸浮細(xì)胞容易成團(tuán)
  • 培養(yǎng)基提前變色
  • 鏡下發(fā)現(xiàn)有小黑點(diǎn)

如果排除了其他試劑選擇不當(dāng)、細(xì)胞株老化、細(xì)菌污染……原因,而仍有上述一種或幾種情況,則高度提示:細(xì)胞可能出現(xiàn)了支原體污染。

據(jù)報(bào)道,細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生支原體污染的機(jī)率較高,會(huì)達(dá)到70%左右,常規(guī)抗生素的使用對(duì)支原體幾乎無效。

那么,支原體污染,對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有什么危害呢?

支原體污染的危害

1. 細(xì)胞狀態(tài)不佳,生長(zhǎng)速度慢,實(shí)驗(yàn)無法推進(jìn)

2. 細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確,時(shí)間、經(jīng)費(fèi)的浪費(fèi)

3. 一株污染的細(xì)胞成為實(shí)驗(yàn)室的污染源,對(duì)工作區(qū)域以及培養(yǎng)箱和液氮罐造成污染,進(jìn)而污染其他細(xì)胞,導(dǎo)致其他細(xì)胞繼發(fā)性污染,實(shí)驗(yàn)受影響,數(shù)據(jù)無法重復(fù),預(yù)期結(jié)果出不來

圖:支原體給細(xì)胞帶來的諸多影響

圖:一管細(xì)胞的污染可影響到其他細(xì)胞

那么,怎樣明確細(xì)胞是否有支原體污染呢?

目前普遍使用的支原體檢測(cè)方法

1、支原體的分離培養(yǎng)

它是支原體污染鑒定的金標(biāo)準(zhǔn),準(zhǔn)確,價(jià)格便宜。但支原體在分離培養(yǎng)的過程中,要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間,所需時(shí)間較長(zhǎng)。

2、ELISA方法

檢測(cè)步驟復(fù)雜,出現(xiàn)誤差的幾率較高,對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作技巧有要求。同時(shí)試劑盒成本較高,普遍不被選用。

3、DNA熒光染色法

它采用熒光染色劑Hoechst 33258和支原體DNA富含A-T的區(qū)域結(jié)合。價(jià)格適中。由于DNA檢測(cè)需要將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng),因此一般需要幾天后才出結(jié)果。有假陽(yáng)性和假陰性,需要與其他方法結(jié)合使用。

4、PCR技術(shù)

它根據(jù)支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設(shè)計(jì)引物,對(duì)待檢樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增,通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析作出診斷(見下圖)。操作簡(jiǎn)單、速度快,只需2-3小時(shí)即可出結(jié)果,通量高,價(jià)格適中。

但是,不同廠家生產(chǎn)的PCR檢測(cè)試劑盒由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)的不同,其準(zhǔn)確度和敏感度有天壤之別。

目前,被各大實(shí)驗(yàn)室及生物藥廠普遍選用的是德國(guó)Minerva Biolabs公司開發(fā)生產(chǎn)的支原體PCR檢測(cè)試劑盒。試劑盒在267bp的條帶,涵蓋了歐洲《藥典》中zui易感染細(xì)胞的26種支原體亞型,保證了其*的敏感度;通過內(nèi)控條帶的設(shè)計(jì),防止了假陰性的發(fā)生。

我國(guó)*在2008年豬藍(lán)耳病疫苗研制的重點(diǎn)項(xiàng)目中,實(shí)驗(yàn)者用此檢測(cè)法與培養(yǎng)法做了超過100次的平行比對(duì)實(shí)驗(yàn),結(jié)果全部一致,假陽(yáng)性率和假陰性率為零。

因此,用PCR方法檢測(cè)支原體,其準(zhǔn)確性與選擇的試劑盒的質(zhì)量有直接相關(guān)性。

圖:有支原體污染的樣本在267bp位置有陽(yáng)性條帶。Internal Control為內(nèi)部對(duì)照,在190bp,保證PCR反應(yīng)的正常。


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