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細胞狀態(tài)不好,你排除過支原體嗎?

閱讀:802發(fā)布時間:2017-10-19

當我們在養(yǎng)細胞的時候,有可能會出現如下的狀況:

  • 細胞生長緩慢
  • 細胞變形
  • 碎片增加
  • 懸浮細胞容易成團
  • 培養(yǎng)基提前變色
  • 鏡下發(fā)現有小黑點

如果排除了其他試劑選擇不當、細胞株老化、細菌污染……原因,而仍有上述一種或幾種情況,則高度提示:細胞可能出現了支原體污染。

據報道,細胞培養(yǎng)中發(fā)生支原體污染的機率較高,會達到70%左右,常規(guī)抗生素的使用對支原體幾乎無效。

那么,支原體污染,對細胞培養(yǎng)有什么危害呢?

支原體污染的危害

1. 細胞狀態(tài)不佳,生長速度慢,實驗無法推進

2. 細胞內DNA、RNA及蛋白表達發(fā)生改變,影響實驗結果,導致實驗數據不準確,時間、經費的浪費

3. 一株污染的細胞成為實驗室的污染源,對工作區(qū)域以及培養(yǎng)箱和液氮罐造成污染,進而污染其他細胞,導致其他細胞繼發(fā)性污染,實驗受影響,數據無法重復,預期結果出不來

圖:支原體給細胞帶來的諸多影響

圖:一管細胞的污染可影響到其他細胞

那么,怎樣明確細胞是否有支原體污染呢?

目前普遍使用的支原體檢測方法

1、支原體的分離培養(yǎng)

它是支原體污染鑒定的金標準,準確,價格便宜。但支原體在分離培養(yǎng)的過程中,要長出明顯克隆至少需要4周時間,所需時間較長。

2、ELISA方法

檢測步驟復雜,出現誤差的幾率較高,對實驗者操作技巧有要求。同時試劑盒成本較高,普遍不被選用。

3、DNA熒光染色法

它采用熒光染色劑Hoechst 33258和支原體DNA富含A-T的區(qū)域結合。價格適中。由于DNA檢測需要將可疑樣品與指示細胞共同培養(yǎng),因此一般需要幾天后才出結果。有假陽性和假陰性,需要與其他方法結合使用。

4、PCR技術

它根據支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設計引物,對待檢樣本DNA進行擴增,通過對擴增產物的大小分析作出診斷(見下圖)。操作簡單、速度快,只需2-3小時即可出結果,通量高,價格適中。

但是,不同廠家生產的PCR檢測試劑盒由于引物及內在設計的不同,其準確度和敏感度有天壤之別。

目前,被各大實驗室及生物藥廠普遍選用的是德國Minerva Biolabs公司開發(fā)生產的支原體PCR檢測試劑盒。試劑盒在267bp的條帶,涵蓋了歐洲《藥典》中zui易感染細胞的26種支原體亞型,保證了其*的敏感度;通過內控條帶的設計,防止了假陰性的發(fā)生。

我國*在2008年豬藍耳病疫苗研制的重點項目中,實驗者用此檢測法與培養(yǎng)法做了超過100次的平行比對實驗,結果全部一致,假陽性率和假陰性率為零。

因此,用PCR方法檢測支原體,其準確性與選擇的試劑盒的質量有直接相關性。

圖:有支原體污染的樣本在267bp位置有陽性條帶。Internal Control為內部對照,在190bp,保證PCR反應的正常。


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