一、Taq酶原因

本公司現(xiàn)為世界上zui大的合成DNA專業(yè)公司之一,每天為世界各地用戶合成約2100條引物。在這些大量的引物中大多用于PCR擴(kuò)增,約有萬分之五左右的在DNA測序后,發(fā)現(xiàn)在引物部分有錯(cuò)誤,錯(cuò)誤大部分表現(xiàn)為丟失。許多用戶認(rèn)為這種錯(cuò)誤是我們公司合成錯(cuò)誤造成的。 實(shí)際上這種錯(cuò)誤是由于Taq酶固有的錯(cuò)誤概率造成的,與合成無關(guān)。 

可以清楚的看出，引物部分也被Taq擴(kuò)增，既然引物也被擴(kuò)增，那么錯(cuò)誤就可能發(fā)生。 那么化學(xué)合成DNA會(huì)不會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤呢? 回答是否定的。 錯(cuò)誤無非有兩種:一是堿基被置換；二是堿基丟失。本公司的80多臺(tái)DNA合成儀全部為ABI公司產(chǎn)品，ABI的DNA合成儀是世界上zui可靠的，至今尚未聽說過ABI的DNA合成儀在合成一個(gè)堿基時(shí)，卻錯(cuò)誤地加上另一個(gè)堿基（G,C or T），丟失更不可能。因?yàn)?/span>DNA合成是在固相上進(jìn)行的，每一個(gè)堿基的合成包含了脫保護(hù)基（DMT）、堿基的加成、蓋帽（Capping）、氧化等步驟。如果說某一個(gè)堿基由于種種原因（如瓶中溶液沒有了，或管道堵塞），未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一個(gè)反應(yīng)Capping將會(huì)把Oligo封死，使整個(gè)oligo合成立即中止。 可見，以上PCR產(chǎn)物測序時(shí)發(fā)生在引物部分的錯(cuò)誤不是引物合成的失誤，而是Taq酶造成的。

二、化學(xué)原因

在合成過程中，如果本公司提供的DNA合成報(bào)告單是正確的，表示合成是成功的。人為因素造成堿基突變的可能性是*可以排除的。DNA合成專家Dr. Hecker和Dr. Rill對此作了一評論，認(rèn)為化學(xué)合成的DNA片段要比天然的DNA片段有更多的堿基突變概率。但其真正的化學(xué)機(jī)理還不太清楚，但可以肯定的是要保證100％不發(fā)生錯(cuò)誤是不可能的。

三、解決的辦法:
1.  建議用高保真的高溫聚合酶，如本公司推出的Super Pfu、Pfu 、Taq plus等，保真性比Taq酶高10倍左右，可有效的減少差錯(cuò)。 
2.  再挑選一個(gè)克隆進(jìn)行DNA測序，一般來說再次出現(xiàn)錯(cuò)誤的可能性就更小了。 
3. 重新合成引物。 
4. 將您有缺失堿基的克隆送到我們基因部，我們負(fù)責(zé)將缺失的堿基進(jìn)行點(diǎn)突變，提供您所需要得正確序列。 但由于客戶的載體非常復(fù)雜和多變，我們承諾的是提供

 DNA損傷的來源
1.1 堿基脫落形成AP位點(diǎn)
熱和酸等都可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落，形成AP位點(diǎn)（Apurinic orApyrimidinic site ）。
烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點(diǎn)。
1.2 堿基的改變
①物理因素
電離輻射可引起其它物質(zhì)產(chǎn)生自由基，從而引起堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。
一般嘧啶比嘌呤更敏感。
②化學(xué)因素
a. 烷化劑
*、甲烷磺酸甲酯（MMS）等烷化劑可將烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上使堿基烷基化。
鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3zui容易受攻擊，形成m7G和m3A烷基化的嘌呤堿基，導(dǎo)致復(fù)制時(shí)堿基錯(cuò)配。
例如鳥嘌呤N7被烷化后會(huì)與T配對，結(jié)果會(huì)使G-C轉(zhuǎn)變成A-T。
b. 堿基類似物
5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。它們的結(jié)構(gòu)與堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成。
如5-BU與T結(jié)構(gòu)相似，在酮式結(jié)構(gòu)時(shí)與A配對；它更易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對，在DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致A-T轉(zhuǎn)換為G-C。 
c. 黃曲mei素
黃曲mei素B、1,2-乙酰-氨基芴、苯并芘、吖啶等可插入堿基序列，引起移碼。 
d. 硝酸鹽
亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，經(jīng)過復(fù)制就可使DNA上的G-C變成A-T對。 
③堿基的自發(fā)改變和損傷
a. 堿基的異構(gòu)互變
4種堿基各自的異構(gòu)體間都可自發(fā)地互變（烯醇式與酮式間的互變），這會(huì)使堿基間發(fā)生錯(cuò)配，使A-C、T-G等。
b. 堿基的脫氨基作用
堿基的環(huán)外NH2有時(shí)會(huì)自發(fā)脫落，使C→U、A→次黃嘌呤（I）、G→黃嘌呤（X）等，DNA復(fù)制時(shí)，U-A、I-X、I-C配對，導(dǎo)致子代DNA序列錯(cuò)誤。
5-甲基胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生T（引起C-G→T-A的變化），而C脫氨基產(chǎn)生U（它通常被移出或被C代替）。
④氧自由基傷害
細(xì)胞代謝副產(chǎn)物O2-、H2O2等會(huì)造成堿基損傷，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，引起堿基配對錯(cuò)誤。
1.3 堿基插入或缺失
吖啶類分子帶正電呈扁平狀，易于嵌入DNA堿基平面間，導(dǎo)致在復(fù)制或重組過程中缺失或插入一個(gè)堿基。
DNA聚合酶在復(fù)制過程中發(fā)生滑動(dòng)，尤其在連續(xù)幾個(gè)相同堿基的區(qū)段產(chǎn)生1個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失或插入。聚合酶在模板鏈上滑動(dòng)易于造成缺失，在生長鏈上滑動(dòng)易于造成插入。
插入或缺失會(huì)導(dǎo)致讀碼框改變。
1.4 嘧啶二聚體
DNA受到紫外線照射時(shí)，使DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵連成二聚體。
相鄰2個(gè)T；或2個(gè)C；或C與T間都可形成環(huán)丁基二聚體；相鄰2個(gè)T間zui易形成TT二聚體。
1.5 DNA鏈斷裂
電離輻射可使DNA鏈斷裂；射線的直接和間接作用都可能使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開而致DNA鏈斷裂。
烷化劑也可使DNA鏈斷裂；DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧易被烷化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。
對單倍體細(xì)胞一個(gè)雙鏈斷裂就是致死性事件。