7-AAD Cell Cycle Analysis Kit細(xì)胞周期檢測試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

7-AAD 細(xì)胞周期檢測試劑盒（7-AAD Cell Cycle Analysis Kit）是一款采用7-AAD染色法進(jìn)行細(xì)胞周期檢測的試劑盒，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。本試劑盒通常用于貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測。對于組織樣品，需經(jīng)消化成單細(xì)胞后才可用此試劑盒進(jìn)行檢測。

7-氨基放線jun素D（7-Aminoactinomycin D,7-AAD）是一種不具有膜滲透性的DNA結(jié)合染料（選擇性插入DNA的GC富集區(qū)），通常被活細(xì)胞排除在外?；罴?xì)胞和早期凋亡細(xì)胞排斥7-AAD不被染色，但具損傷質(zhì)膜或受損/無代謝活動(dòng)的細(xì)胞無法阻擋染料進(jìn)入而被染色。7-AAD/DNA復(fù)合物能被488nm的氬離子激發(fā)器，發(fā)生大的斯托克斯遷移，發(fā)射波長在647nm。細(xì)胞經(jīng)7-AAD染色后，假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么，含雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度理論值為2，正在進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度介于1-2（見附圖I）。

產(chǎn)品組成

保存與運(yùn)輸方法

保存：染色緩沖液+4℃保存，7-AAD染色液+4℃避光保存，RNase A-20℃保存，一年有效。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 因7-AAD也能結(jié)合RNA，因此，試劑盒內(nèi)提供RNase A用來降解RNA，以降低背景熒光。然而，雖有資料顯示，7-AAD不和RNA結(jié)合，但從我司的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，添加RNase處理的效果更好。

2） 因7-AAD不具有細(xì)胞膜滲透性，則需先對細(xì)胞進(jìn)行乙醇固定，再進(jìn)行后續(xù)染色。

3） 請自行準(zhǔn)備95%乙醇和PBS。

4） 熒光染料均存在熒光淬滅，保存和使用過程中請注意避光，以減緩淬滅。

5） 因7-AAD對人體有刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)。

6） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 染色步驟

1.1 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量可以為500萬以上。

a）對于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一干凈離心管內(nèi)備用。用胰mei消化細(xì)胞，直至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000rpm離心3-5min，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入1ml冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。

b）對于懸浮細(xì)胞：1000rpm離心5min沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入1ml 冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。

c）對于組織樣本：用剪刀將組織剪成盡量小的小塊后，用0.25%胰mei消化30-60min（或根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)幕旌厦竵磉M(jìn)行組織消化），經(jīng)過200-400目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾得到單細(xì)胞懸液。然后參照步驟b）對于懸浮細(xì)胞來準(zhǔn)備樣品。

1.2 細(xì)胞固定：取4ml冰浴預(yù)冷的95%乙醇，一邊低速渦旋震蕩的同時(shí)逐滴加入1ml細(xì)胞懸液（冰上操作），混勻后于4℃固定2h或更長時(shí)間，固定12~24h可能效果更佳。1500rpm離心5min沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的乙醇固定液，以避免吸走細(xì)胞。加入約5ml冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。輕輕彈動(dòng)離心管底以分散細(xì)胞避免細(xì)胞成團(tuán)。

1.3 7-AAD染色工作液的配制：參照下表根據(jù)實(shí)際檢測樣本的數(shù)量配制足量的7-AAD染色工作液【注意：7-AAD染色工作液短時(shí)間可4℃保存，但需當(dāng)日使用】。

1.4 染色：每管細(xì)胞樣品中加入0.1ml 7-AAD染色工作液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光孵育30min。隨后可置于4℃或冰浴避光存放。

1.5 加入2ml PBS，1500rpm離心5min，去上清。

1.6 加入500μl PBS，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測?！菊?jiān)?4h內(nèi)完成流式檢測，能在當(dāng)天完成流式檢測?！?/p>

1.7 流式檢測與分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm處檢測紅色熒光（7-AAD通道或PerCP通道），同時(shí)檢測光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行DNA含量和光散射分析。

【注意】：j上機(jī)時(shí)，熒光通道設(shè)置為線性放大（Linear Scale）；k數(shù)據(jù)分析，去除粘連細(xì)胞。

相關(guān)產(chǎn)品

附圖I.典型的7-AAD細(xì)胞周期示例圖（參考用）

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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