AO/EB Double Staining Kit AO/EB雙染試劑盒

關(guān)鍵詞：

吖啶橙（Acridine Orange，AO）；溴化乙錠（Ethidium Bromide, EB）；Apoptotic cell 凋亡細(xì)胞；Necrotic cells壞死細(xì)胞；Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡雙染；

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一種異染的核酸結(jié)合染料，具細(xì)胞膜滲透性，通過插入或靜電吸引的方式與DNA或RNA結(jié)合。當(dāng)與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合發(fā)射綠色熒光（Ex/Em=502/525nm），與單鏈DNA（ssDNA）或RNA結(jié)合發(fā)射紅色熒光（Ex/Em=460/650nm），少量結(jié)合呈橙紅色熒光。溴化乙錠（Ethidium Bromide, EB）是一種多環(huán)芳烴熒光小分子和核酸插入劑，嵌合到雙鏈DNA或RNA的堿基對(duì)內(nèi)，無堿基特異性，呈紅色熒光（（Ex/Em=518/605nm）。EB不具細(xì)胞膜滲透性。

吖啶橙（AO）和溴化乙錠（EB）常常聯(lián)合使用來觀察細(xì)胞核變化和凋亡小體形成，這些都是凋亡的特征。兩者結(jié)合能區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。工作原理在于吖啶橙能同時(shí)染活細(xì)胞和死細(xì)胞，EB只能對(duì)喪失膜完整性的細(xì)胞進(jìn)行染色?；罴?xì)胞呈均勻的綠色。早期凋亡細(xì)胞呈綠色，并且在細(xì)胞核能看到亮綠色的點(diǎn)，由于染色體濃縮和核斷裂。晚期凋亡細(xì)胞也會(huì)被EB著色，從而染成橙紅色，但，與壞死細(xì)胞相比，晚期凋亡細(xì)胞會(huì)有濃縮和常常斷裂的核。壞死細(xì)胞也被染成橙紅色，但會(huì)有和活細(xì)胞相似的核形態(tài)，沒有濃縮的染色體。

我司（懋康生物）提供的AO/EB雙染試劑盒（AO/EB Double Staining Kit）提供完整的試劑，操作簡(jiǎn)單，根據(jù)說明書操作能做100個(gè)反應(yīng)。

產(chǎn)品包裝

注意事項(xiàng)

1）AO與EB都有一定毒性，請(qǐng)小心操作。

2）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. 染色工作液的制備

于正式實(shí)驗(yàn)前，取吖啶橙染液（試劑A）、溴化乙錠染液（試劑B）、稀釋緩沖液（試劑C），按照A:B:C=1:1:8的比例稀釋成所需的AO/EB染色工作液。

2. 細(xì)胞準(zhǔn)備

貼壁細(xì)胞：按照常規(guī)方法消化。于1000rpm離心5min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS清洗一次。

懸浮細(xì)胞：于1000rpm離心5min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS清洗一次。

之后用稀釋緩沖液（試劑C）重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5-5×10⁶個(gè)/ml。

3. 染色

每25μl細(xì)胞懸液中，加入2μl 新鮮制備的AO/EB染色工作液，輕輕混合均勻。室溫孵育5~10min。

4. 觀察

取干凈載玻片，滴加5~10μl 染色的細(xì)胞懸液，蓋上蓋玻片。使用熒光顯微鏡的熒光素濾片和60倍放大的物鏡來觀察和計(jì)數(shù)。該測(cè)定至少重復(fù)三次，每次觀察的總細(xì)胞至少100個(gè)。

【注意】：根據(jù)細(xì)胞類型選擇理想的物鏡放大倍數(shù)（更高或更低），前提是必須看清核形態(tài)。

應(yīng)用示例（來自文獻(xiàn)）：

文獻(xiàn)：Dual AO/EB Staining to Detect Apoptosis in Osteosarcoma Cells Compared with Flow Cytometry.

染色方法：Dual fluorescent staining solution (1 μl) containing 100 μg/ml AO and 100 μg/ml EB (AO/EB) was added to each suspension and then covered with a coverslip. The morphology of apoptotic cells was examined and 500 cells were counted within 20 min using a fluorescent microscope (OLYMPUS). Dual acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining method was repeated 3 times at least.

Fig. (A) 陰性對(duì)照細(xì)胞（正常細(xì)胞）：環(huán)形細(xì)胞核均勻分布在細(xì)胞中央。(B)實(shí)驗(yàn)組 (早期凋亡細(xì)胞): 吖啶橙（AO）染色后的細(xì)胞核呈黃綠色熒光，以月牙形或顆粒的形態(tài)聚集位于細(xì)胞的一邊。(C) 實(shí)驗(yàn)組 (晚期凋亡細(xì)胞): 經(jīng)EB染色后的細(xì)胞核呈橙紅熒光，集中聚集且偏重定位。(D) 壞死細(xì)胞：壞死細(xì)胞體積增加，顯示平整的橙紅色熒光和不清晰的輪廓。細(xì)胞正要溶解或接近崩潰。

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— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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AO/EB雙染試劑盒 細(xì)胞增值

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