X-Gal（α-半乳糖苷酶顯色底物/酵母雙雜交檢測）

— 酵母雙雜交檢測系統(tǒng)/蛋白-蛋白相互作用分析

搜索關鍵詞：X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；α-半乳糖苷酶 a-galactosidase；MEL1基因；GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)；藍白斑篩選；CAS：107021-38-5；

X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷，CAS：107021-38-5），一種用來檢測α-半乳糖苷酶（也稱為蜜二糖酶，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.22）活性的顯色底物。X-α-Gal的使用，避開雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實驗（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養(yǎng)基上，通過藍色沉淀的生成與否，即可用來檢測雙雜

X-Gal簡介：

X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷，CAS：107021-38-5），一種用來檢測α-半乳糖苷酶（也稱為蜜二糖酶，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.22）活性的顯色底物。X-α-Gal的使用，避開雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實驗（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養(yǎng)基上，通過藍色沉淀的生成與否，即可用來檢測雙雜交相互作用。X-α-Gal可用來區(qū)分腸桿菌科內(nèi)的不同物種以及劃分乳酸菌和雙歧桿菌。組織學研究中，X-α-Gal還可借助光學顯微鏡來檢測組織的α-半乳糖苷酶活性。

一旦GAL4激活，α-半乳糖苷酶分泌，之后水解培養(yǎng)基上的X-α-Gal，使得菌落產(chǎn)生藍斑。酵母雙雜交研究用的工程菌包括AH109，PJ69-2A，Y190和Y187。

優(yōu)勢：

避開雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實驗（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養(yǎng)基上，通過藍色沉淀的生成與否，即可用來檢測雙雜交相互作用。

與酵母雙雜交系統(tǒng)：

酵母雙雜交篩選是體內(nèi)用來檢測蛋白-蛋白相互作用的一種遺傳分析實驗，此方法由Prof. Stan Fields及合作者開發(fā)用來調(diào)查兩個已知蛋白的相互作用，另一個重要應用是從文庫內(nèi)篩選并鑒定某一特定蛋白的未知結合蛋白。陽性克隆也就是那些能夠激活報告基因轉錄子，使得營養(yǎng)缺陷型酵母雙雜交菌株在營養(yǎng)缺陷選擇性培養(yǎng)基上生長的菌落。大多數(shù)雙雜交方法使用大腸桿菌的LacZ基因作為第二個報告基因，通常要使用非常耗時的filter-lift assay來鑒定能在第二種選擇性平板上生長的菌落。而替換使用的X-α-Gal，可直接在營養(yǎng)缺陷性的選擇培養(yǎng)基上來檢測基于GAL4-轉錄子的雙雜交作用。

基本特性：

CAS 07021-38-5

化學名：5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；X-α-D-Galactoside X-α-D-半乳糖苷；

分子式：C14H15BrClNO6

4）   分子量：408.64g/mol

5）   純度：≥98%（TLC）

6）   外觀：白色或近白色結晶粉末

7）   化學結構：

使用方法【懋康整理】

方法1：直接倒入固體培養(yǎng)基

溶解60mg X-α-gal于3ml DMF得20mg/ml儲存液，馬上使用或者避光儲存于-20℃，6個月穩(wěn)定；

將高壓滅菌好的瓊脂培養(yǎng)基于室溫冷卻至50℃；

按照每升培養(yǎng)基加入1ml 20mg/ml X-α-gal儲存液的用量，直接加入冷卻好的瓊脂培養(yǎng)基；【若有需要，此時也可加入篩選用的抗生素】；

倒平板，使用前必須讓培養(yǎng)基室溫凝固（通常至少需30min）。

方法2：涂布于預制培養(yǎng)平板上

溶解24mg X-α-gal于6ml DMF得4mg/ml儲存液，馬上使用或者避光儲存于-20℃，6個月穩(wěn)定；

超凈工作臺內(nèi)放置已經(jīng)倒好的固體培養(yǎng)基，使其表面干燥；

吸取200μl (15cm平板) 或100μl（10cm平板）4mg/ml X-α-gal 儲存液于預制培養(yǎng)平板上，并涂布使其均勻分散在表面【注意：平板邊緣通常很難得以充分涂布，可能導致假陽性克隆生成。建議條件可能下，于平板中央挑取克隆】。

使用前將上述涂布好的篩選平板于超凈工作臺內(nèi)，至少晾干30min；

將轉化好的細菌或酵母涂于平板上，分別置于37℃或30℃倒置培養(yǎng)，直至藍色菌落出現(xiàn)。

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