Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry

細(xì)胞表面抗原免疫熒光染色（流式分析）

細(xì)胞表面抗原免疫熒光染色-流式分析步驟：

此步驟做交流學(xué)習(xí)用，具體的實(shí)驗(yàn)方案因?qū)嶒?yàn)而異。

A．組織和細(xì)胞收集

1. 收集理想組織（如脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、骨髓）并制備懸浮于細(xì)胞染色緩沖液（cell staining buffer）的單細(xì)胞懸液。如果使用體外刺激細(xì)胞，只需將刺激活化的細(xì)胞簡(jiǎn)單懸浮于細(xì)胞染色緩沖液（cell staining buffer）。
2. 加細(xì)胞染色緩沖液（cell staining buffer）高達(dá)~15ml，然后350xg離心5min，吸掉上清。

B．紅細(xì)胞裂解

1. 用3ml 紅細(xì)胞裂解液（1× RBC Lysis Buffer）重懸細(xì)胞或根據(jù)具體情況加入相應(yīng)量的紅細(xì)胞裂解液。冰上孵育5min。
2. 加10ml細(xì)胞染色緩沖液（cell staining buffer）到管內(nèi)終止細(xì)胞裂解，然后350xg離心5min，吸掉上清。
3. 如步驟2重復(fù)一次清洗。
4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，用細(xì)胞染色緩沖液沖重懸細(xì)胞使?jié)舛葹?/span>5-10 x 10⁶ cells/ml，按照100µl/管分裝細(xì)胞懸液到12 x 75mm塑料管中（5-10 x 10⁵ cells/ml）。

C．Fc受體封閉

1. 阻斷Fc受體的試劑適用于降低非特異性免疫熒光染色。小鼠樣本，使用特異性結(jié)合FcγR III/II的TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) 抗體可用于封閉抗體的非特異性染色。此種情況下，100 µl染色體積按照每10⁶個(gè)細(xì)胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) 抗體，混勻，冰上孵育5-10min。
2. 人樣本，每100 µl染色體積加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution，Fc受體封閉劑)，混勻，室溫孵育5-10min。在不含有有效/可得的封閉抗體情況下，使用過量的相同物種來源的純化IgG和免疫熒光染色用抗體相同來源的IgG亞型作為替代方法來封閉細(xì)胞。

D．抗體的細(xì)胞表面染色

1. 按照預(yù)先優(yōu)化的濃度，加入合適的熒光素、生物素偶聯(lián)抗體或純化的一抗（如： anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC），冰上避光孵育15-20min。
2. 至少使用2ml細(xì)胞染色緩沖液（cell staining buffer）清洗細(xì)胞，350xg離心5min，吸掉上清。重復(fù)一次。
3. 如果使用純化的一抗，需在殘留的緩沖液中重懸細(xì)胞，加入預(yù)先優(yōu)化濃度的熒光二抗，冰上避光孵育15-20min。
4. 重復(fù)步驟10。
5. 用0.5ml細(xì)胞染色緩沖液（cell staining buffer）重懸細(xì)胞，每10⁶個(gè)細(xì)胞加入5µl（0.25µg）7-AAD染色液（ 7-AAD Viability Staining Solution）對(duì)死細(xì)胞染色。
6. 避光冰上孵育3-5min。
7. 用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。【注意】：如果不能立即使用流式細(xì)胞儀分析樣品，避光保存樣品，并且置于4-8℃保存。樣品必須重懸于細(xì)胞染色液中。注意細(xì)胞樣品不應(yīng)該放在固定緩沖液更長(zhǎng)時(shí)間，因其會(huì)影響熒光素構(gòu)象和熒光信號(hào)。

實(shí)驗(yàn)材料：