2016年7月25日，學(xué)術(shù)刊物自然出版集團(tuán)旗下子刊《Nature Structural & Molecular Biology》雜志上在線發(fā)表了浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院朱永群實(shí)驗(yàn)室題為“Structural Basis for Cas3 Inhibition by the Bacteriophage Protein AcrF3”的研究論文，研究揭示噬菌體蛋白AcrF3抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)效應(yīng)分子Cas3的分子機(jī)理。國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心的姚德強(qiáng)博士和朱永群實(shí)驗(yàn)室博士生王小飛為論文共同*作者，朱永群教授和助理研究員周艷博士為本文的共同通訊作者。

病原菌中廣泛擁有CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，用于抵抗來自病毒(噬菌體)或者質(zhì)粒等外源核酸類物質(zhì)的入侵。其中I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)在細(xì)菌中存在，其功能主要是由crRNA介導(dǎo)沉默復(fù)合物Cascade和DNA降解效應(yīng)分子Cas3來完成的。Cascade復(fù)合物利用其結(jié)合的crRNA分子，特異地識別目標(biāo)DNA，在目標(biāo)DNA上形成特殊的R-loop結(jié)構(gòu)，并招募下游效應(yīng)分子Cas3到R-loop上。由于Cas3同時具有核酸酶活性和DNA解旋酶活性，I型CRISPR-Cas系統(tǒng)利用Cas3將目標(biāo)DNA雙鏈解開并加以降解。在*的細(xì)菌與噬菌體相互斗爭和生物共進(jìn)化過程中，噬菌體也進(jìn)化出了*的蛋白分子，拮抗細(xì)菌宿主CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，從而促進(jìn)自身的生存。其中噬菌體JBD5的AcrF3蛋白能夠特異地作用于綠膿桿菌的Cas3效應(yīng)分子(簡稱PaCas3)，抑制綠膿桿菌的I-F亞型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)。然而，AcrF3這種*的anti-CRISPR活性的具體分子機(jī)制*不清楚。

在這項(xiàng)研究中，朱永群實(shí)驗(yàn)室建立了PaCas3體外核酸酶酶學(xué)實(shí)驗(yàn)體系，發(fā)現(xiàn)PaCas3具有很好的多種二價金屬離子依賴的核酸酶活性。進(jìn)一步的生化實(shí)驗(yàn)揭示AcrF3蛋白在溶液狀態(tài)下形成同源二聚體分子，以高親和力的方式與PaCas3特異地結(jié)合，有效地抑制了PaCas3體外核酸酶活性。通過解析2.6埃高分辨率的PaCas3-AcrF3復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，該研究發(fā)現(xiàn)PaCas3由一個獨(dú)立的N端Cas2結(jié)構(gòu)域、HD型核酸酶結(jié)構(gòu)域、SF2型解旋酶結(jié)構(gòu)域(由RecA1和RecA2兩個亞結(jié)構(gòu)域組成)、Long linker區(qū)以及C端結(jié)構(gòu)域(CTD)所構(gòu)成。單獨(dú)的Cas2蛋白被報道在CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的DNA adaptation(DNA適應(yīng))過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Cas2與Cas1形成摩爾比2：4的整合酶復(fù)合物，將獲取的外源DNA插入CRISPR基因座中。PaCas3擁有獨(dú)立的Cas2結(jié)構(gòu)域，說明PaCas3不同于以往報道的Cas3分子，它同時參與了CRISPR-Cas系統(tǒng)中的DNA適應(yīng)和DNA干擾兩個過程。

在PaCas3-AcrF3復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中，AcrF3以同源二聚體的方式與PaCas3的緊密結(jié)合，這與我們的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果*一致。單個AcrF3分子呈現(xiàn)由六股α-螺旋組成的雙層結(jié)構(gòu)，并通過疏水相互作用、以反向?qū)ΨQ的方式形成同源二聚體分子。破壞二聚體中兩個分子之間的疏水作用，將導(dǎo)致AcrF3*喪失了抑制PaCas3體外核酸酶活性的能力。在復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，AcrF3二聚體結(jié)合在PaCas3 的位于Long linker區(qū)與CTD結(jié)構(gòu)域之間的凹槽區(qū)域，并與PaCas3的HD、Long linker區(qū)、RecA2和CTD結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生了廣泛的相互作用。其中，AcrF3與RecA2之間的相互作用*封閉了PaCas3解旋酶結(jié)構(gòu)域中DNA結(jié)合通道的入口，說明AcrF3的結(jié)合導(dǎo)致PaCas3不能接觸由Cascade呈遞來的目標(biāo)DNA。令人驚訝的是，在復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，PaCas3解旋酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合了一個ADP分子，而不是通常活性解旋酶結(jié)合的ATP分子，表明AcrF3將PaCas3鎖定在非活性的狀態(tài)。通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析，該研究還發(fā)現(xiàn)AcrF3也阻止了Cascade復(fù)合物的Cse1亞基對PaCas3的識別作用，導(dǎo)致Cascade不能招募PaCas3。因此，AcrF3蛋白以同源二聚體為活性單元，通過屏蔽PaCas3對目標(biāo)DNA的接觸、阻斷Cascade復(fù)合物Cse1亞基對PaCas3的招募作用以及將PaCas3鎖定在ADP結(jié)合的非活性狀態(tài)，從而抑制I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，發(fā)揮其anti-CRISPR活性。

這項(xiàng)研究在上從生化和原子水平揭示了噬菌體蛋白抑制病原菌CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制，報道CRISPR-Cas系統(tǒng)效應(yīng)分子與anti-CRISPR蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，向人們展示了I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)效應(yīng)分子Cas3的全新結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對人們了解病原菌與噬菌體相互作用以及細(xì)菌CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)分子機(jī)制具有重要意義。

AcrF3-PaCas3復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)示意圖