子科生物報道：堿基編輯技術（Base Editing）是基于CRISPR系統(tǒng)開發(fā)的基因組定向修飾技術。該技術由于不需要DNA雙鏈斷裂和外源供體DNA可以實現對目的堿基的精zhun替換，在疾病治療、植物性狀改良等方面具有很大的應用潛力。

中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組長期致力于植物基因組編輯技術的創(chuàng)新及應用研究，前期已經在植物中建立了完善的胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine Base Editor, CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（Adenine Base Editor, ABE）技術體系（Zong et al., Nat. Biotechnol. 2017; Zong et al., Nat. Biotechnol. 2018; Li et al., Genome Biol. 2018），但是發(fā)現胞嘧啶堿基編輯器在基因組水平存在脫靶效應（Jin et al., Science 2019）。為解決這一問題，高彩霞研究組通過對人類胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3B）蛋白的理性設計，并結合新型的胞嘧啶堿基編輯篩選方法，開發(fā)出了新型高精度、高編輯活性的胞嘧啶堿基編輯工具。

研究人員首先在水稻原生質體中建立并優(yōu)化了基于R-loop的高通量堿基編輯器特異性評估方法。該方法利用CBE作用于單鏈DNA的特性，通過SpCas9的正交蛋白nSaCas9在編輯靶點外的基因組區(qū)段誘導R-loop，從而人為制造單鏈DNA（single stand DNA, ssDNA）區(qū)域。如果CBE的脫氨活性在這些區(qū)域產生脫靶編輯，可以通過高通量測序進行富集檢測。

該工作首先對已報道的5個胞嘧啶堿基編輯器分別通過R-loop方法和全基因組測序（Whole-genome sequencing, WGS）進行特異性檢測，發(fā)現R-loop方法與 WGS的結果一致，證明了R-loop方法的可靠性。且該方法與WGS相比，更加快速、便捷和經濟。

在此基礎上，研究人員通過對一系列理性設計的基于人源APOBEC脫氨酶的CBE的特異性進行篩選。以編輯效率高且編輯窗口小的A3Bctd（a truncated APOBEC3B deaminase with enzymatic activity）作為蛋白進化的原始底盤，根據蛋白結構信息預測與其脫氨的催化活性和ssDNA結合能力相關的結構域以及這些結構域中的重要氨基酸殘基，通過理性設計獲得16個單氨基酸替換的CBE變體。通過篩選獲得了靶向效率維持較高且能較顯著降低脫靶效應的7種單個氨基酸突變（R211K, T214V,, R311K, Y313F, D314R, D314H 和 Y315M）。

為了進一步降低CBE的脫靶效應，研究人員將這些單氨基酸突變進行組合創(chuàng)制了9個多氨基酸替換變體，zui終篩選得到了兩種靶向編輯效率較高且特異性顯著增加的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3。對編輯產物的分析顯示，這兩種變體在編輯窗口內主要產生單個C或者兩個C的替換，顯著提升了編輯的精確性。zui后，通過對150個水稻編輯植株的全基因組測序數據進一步證明了A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性。

該工作結合基于結構信息的蛋白理性設計、植物個體全基因組脫靶檢測技術和高通量R-loop脫靶檢測技術，進一步提高了單堿基編輯的精確性，開發(fā)出的兩種能保持高編輯效率且無隨機脫靶效應的CBE變體，為基因治療和植物分子設計育種提供了強有力的工具支撐。

相關研究成果結果于2020年7月27日在線發(fā)表在Molecular Cell雜志（DOI:10.1016/j.molcel.2020.07.005)。遺傳發(fā)育所高彩霞研究組博士生靳帥、費宏源、朱子旭以及微生物所副研究員駱迎峰為本文的共同第1作者；高彩霞研究員與王延鵬青年研究員為本文共同通訊作者；明尼蘇達大學張峰博士，遺傳發(fā)育所陳宇航研究員也參與了這項研究。該研究得到了國家轉基因重大科技專項、中國科學院戰(zhàn)略性先導專項A、國家自然科學基金委和中國科學院青促會項目的資助。