免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光，下文主要列舉了三種細(xì)胞免疫熒光染色的實(shí)驗(yàn)步驟。

zo-1的免疫熒光，步驟如下：

1、細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時(shí)，從孵箱中取出。

2、用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘

3、4%的甲醛室溫固定20-30分鐘

4、1×PBS洗3次，每次10分鐘

5、0.2%Triton X-100透化2-5分鐘

6、1×PBS洗3次，每次10分鐘

7、5%BSA室溫封閉30分鐘

8、加一抗(用1%BSA稀釋)放在濕盒里，4度過夜

9、1×PBS洗3次，每次10分鐘

10、加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光!!!

11、1×PBS洗3次，每次10分鐘

12、95%甘油封片

注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋

從大鼠分離的T細(xì)胞能否直接做細(xì)胞免疫熒光

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：

1.取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。

注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。

4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時(shí)，感覺前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。

7.用DAPI染核，然后直接照熒光片。

8.蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。

建議：1.還是染完之后沒有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r(shí)候可能封片會(huì)出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時(shí)間，熒光會(huì)崔滅的。2.熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。

細(xì)胞免疫熒光簡單實(shí)驗(yàn)步驟如下:

1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小時(shí).

2.-20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘

3.PBS洗凈:3min*3

4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS

5.PBS洗凈:2*5min

6.羊血清封閉：37度，20分鐘

7.一抗，4度過夜，一般要大于18小時(shí)或者37度 1-2小時(shí)

8.4度 PBS洗凈，3min*5次

9.二抗 37度小于一小時(shí)

10.37度 PBS洗凈，3*5min

涼干封片(封閉液PH8.5)

不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí)，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時(shí)間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時(shí)間。（子科生物技術(shù)部整理編輯）