一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
二、慢凍程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器
當(dāng)溫度在-25 ℃以上時， 1~2 ℃/min；
當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時， 5~10 ℃/min；
當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中。
2. 簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。
3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽*儲存。
三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用
在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。
四、細(xì)胞凍存方法
1. 預(yù)先配制凍存液
（1）10%DMSO + 細(xì)胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
（2）10%甘油+ 細(xì)胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
2. 取對數(shù)生*細(xì)胞，經(jīng)*消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml）。
3. 加入1 ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮*保存。
五、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法
1. 快速解凍
凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。
2. 解凍后的細(xì)胞可直接接種到含*生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。
3. 如果細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感
解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
注意事項(xiàng)：
1. 從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但為對數(shù)生*細(xì)胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。
2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護(hù)工作，以免凍傷。
3. 凍存和復(fù)蘇用新配制的培養(yǎng)液。
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