實(shí)驗(yàn)材料

1  生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞 

2  新鮮培養(yǎng)基 

3  DMSO （Sigma D-2650） 

4  無菌塑料冷凍保存管（Nalgene 5000-0020） 

5  0.4 ％ w/v trypan blue （GibcoBRL 15250-061） 

6  血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片 

7  等速降溫機(jī)（KRYO 10 Series II） 

步驟： 
1  冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。 

2  配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，zui后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。 

3  依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液（約0.1 ml） 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。 

4  離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量
     細(xì)胞懸浮液作污染檢測。 

5  冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 oC 10 分鐘→ -20 oC 30 分鐘→ -80 oC 16～18 小時(shí)（或隔夜） →液氮槽vapor phase 長期儲存。 

6  冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。

1 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好（log phase） 且存活率高之狀態(tài)，約為80 – 90 ％致密度。 

2 冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。 

3 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色（以0.22 micron FGLP flon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650），以5~10 ml 小體積分裝，4 ℃  避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。 

6 冷凍保存之細(xì)胞濃度： 

     6.1  normal human fibroblast: 1~3 x 10⁶ cells/ml 

     6.2  hybridoma: 1~3 x 10⁶ cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去。 

     6.3  adherent tumor lines: 5~7 x 10⁶，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10⁶ cells/ml。 

     6.4  other suspensions: 5~10 x 10⁶ cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 10⁶cells/ml。 

7 冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。 

8 冷凍方法： 

     8.1 傳統(tǒng)方法: 4  ℃ 10 分鐘---> -20 ℃  30 分鐘---> -80 ℃  16 - 18 小時(shí)（或隔夜）---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。 

     8.2  程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1 ～ -3  ℃ /分鐘之速度由室溫降至–120 ℃ ，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。