一、目的和要求

1 學(xué)習(xí)和掌握用*法及鹽溶液法從動物組織提取核酸的原理及操作技術(shù)。
2 練習(xí)從動物組織提取RNA，并鑒定純度。

二、實驗原理

利用*法可以直接從動物組織中提取RNA，組織勻漿用*處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水層中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后RNA即呈白色絮狀沉淀析出。

三、操作步驟

1 稱取3克肝組織，剪成小塊，置于研缽中，加3-4滴90%的*溶液后研磨，勻漿中加入15mL水，轉(zhuǎn)移至三角燒瓶中，加10mL酚至三角燒瓶中。

2 室溫下劇烈振蕩45分鐘，于3000rpm離心20分鐘。

3 用吸管將上層液吸出，并加入1/2體積的氯仿-異戊醇，于低溫下振蕩20分鐘，以除去提取液中的蛋白質(zhì)，以2000rpm離心10分鐘，吸出上層清液，向上清液中加入*粉末，使zui后濃度大約為2%，裝入小燒杯后，一邊攪拌，一邊緩慢加入兩倍于上清液體積的95%乙醇以沉淀RNA。

4 于冰浴中放置半小時后，以1000rpm離心5分鐘，沉淀再用少量75%乙醇洗滌1-2次，收集沉淀，置于干燥器內(nèi)干燥，稱重。

5 測定A260/A280的值，應(yīng)大于1.85，若小于1.85，則說明含雜蛋白和DNA高了。

四、試劑的配制

1. NaCl溶液（C.P.）（10%）
2. HCl溶液（6N）
取500mL濃鹽酸，用水稀釋至1000mL。
3. 乙醇（C.P.）（95%）
4. 苔黑酚試劑（又稱地衣酚試劑）
將200mg苔黑酚溶于100mL濃鹽酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。
（低溫貯藏一周）
5. 二苯胺試劑
將1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL濃硫酸（比重1.84）。
（臨用時配制，用前可加幾滴乙醛。）

五、操作步驟

1. 取材
在天平上準(zhǔn)確稱取*3.00g，轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶中。
2. 濃鹽浸提
取27mL 10%NaCl溶液，加入到含*的錐形瓶中，攪拌均勻；置于90～100°C水浴中，浸提30～60分鐘；冷卻。
3. 離心
將錐形瓶中提取液和沉淀全部轉(zhuǎn)移至100mL離心管中，取10mL H2O洗滌錐形瓶，并入離心管中；平衡后以4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘；將上清液（即RNA提取液）傾入50mL燒杯中，棄去沉淀（菌體殘渣）。
4. 沉淀RNA
（1） 冷卻：將50mL燒杯置于放有冰塊的250mL燒杯中冷卻；將溫度計插入50mL燒杯中，待溶液冷至10°C以下時，取出溫度計。
（2） 調(diào)pI：緩慢滴加6NHCl于50mL燒杯中，用玻棒一邊輕輕攪拌溶液，一邊測量pH值，調(diào)節(jié)溶液pH至2.0～2.5范圍，溶液中白色沉淀逐漸增多，到等電點時沉淀量zui多；繼續(xù)在冰浴中靜止15分鐘，使沉淀充分。
（注意：①嚴(yán)格控制pH；②若攪拌過快核酸難以凝聚沉淀。）
5. 離心
將小燒杯中溶液和沉淀移至離心管中，再次平衡、離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘）；棄去上清液，保留RNA沉淀。
6. 洗滌與抽濾
（1） 洗滌：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的離心管中，懸浮沉淀，浸泡5分鐘。
（2） 抽濾：取大小合適的濾紙，先在數(shù)字顯示天平上稱重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇濕潤濾紙，開啟真空泵，使濾紙貼緊漏斗，將沉淀及溶液全部轉(zhuǎn)移至布氏漏斗內(nèi)；再用15mL 95%的乙醇洗滌離心管，淋洗濾渣。
7. 干燥
用小鑷子取出布氏漏斗中的沉淀物和濾紙，轉(zhuǎn)移至表面皿上，置于80°C烘箱內(nèi)干燥。
8. 稱重
取出樣品，在室溫下冷卻數(shù)分鐘后，將沉淀物及濾紙置于數(shù)字顯示天平上稱重。
9. 顏色反應(yīng)
（1） 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同時加2滴NaOH助溶。
顏色反應(yīng)：取4支潔凈、干燥的試管，按下表所示順序操作

六、結(jié)果處理

1. 寫出核酸產(chǎn)品的顏色和外形。
2. 計算RNA的粗產(chǎn)品的得率。
3. 由顏色反應(yīng)的結(jié)果，說明產(chǎn)品中含有核酸的情況。

提示：本文動物組織核糖核酸的制備及測定屬于動物實驗文章，主要介紹核糖核酸、動物組織方面的知識，內(nèi)容僅供學(xué)習(xí)交流與參考。

原文地址:/biotech/AnimalExp/2008/k8223947