瓊脂是一種簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)基質(zhì)，可幫助細(xì)胞貼附生長(zhǎng)。本法適用于病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞等易于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，觀察其單個(gè)細(xì)胞的增殖能力。其他大多數(shù)細(xì)胞易于被瓊脂中含有的酸性硫酸多糖所抑制，因此不適用于此試驗(yàn)。

一、材料

1．培養(yǎng)成層的待測(cè)細(xì)胞。

2．O．25％*。

3．20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液及2×DMEM(含20％FCS)培養(yǎng)液。

4．0．7％和1．2％瓊脂糖溶液。

5．直徑6cm或10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(或24孔培養(yǎng)板)、吸管、試管、三角燒瓶、水浴箱等。

二、方法

(一)瓊脂培養(yǎng)液的制備

1．用雙蒸餾水配制成1．2％瓊脂糖和O．7％瓊脂糖。經(jīng)高壓蒸汽滅菌(67．6 kPa)后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2．準(zhǔn)備進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，將瓊脂加熱融化，室溫冷卻至50℃左右時(shí)，浸入45℃水浴中保持融化狀態(tài)。

(二)制備細(xì)胞懸液

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0．25％*消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，做活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106／ml。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(三)制備底層瓊脂

1．用滅菌蒸餾水分別制備出1.2％和0．7％兩個(gè)濃度的低熔點(diǎn)瓊脂液，維持在40℃水浴中不會(huì)凝固。

2．按1：1比例使1.2％的瓊脂和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中(10 cm平皿加7～10ml)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(四)制備上層瓊脂

    按1：1比例將0．7％的瓊脂和2×DMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后取2．7ml，再向管中加入0．3ml的細(xì)胞懸液(6cm平皿)，充分混勻．注入鋪有1．2％瓊脂底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％CO2溫箱中培養(yǎng)10～14d。

三、結(jié)果分析

    逐日將平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆(集落)數(shù)并計(jì)算集落形成率。

    集落形成率=形成集落數(shù)／接種細(xì)胞數(shù)×100％

四、注意事項(xiàng)

   軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過(guò)40℃。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過(guò)35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。