1949年至1960年這一段時(shí)間可以稱為冷凍保存的“甘油時(shí)期”，這一時(shí)期對(duì)生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作為保護(hù)劑。1959年Lovelock等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜。

    按添加保護(hù)劑后的凍存液在冷凍后是否形成冰晶，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種：非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-80~-70℃，然后投入液氮進(jìn)行保存。該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成；玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)劑保護(hù)懸液細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒(méi)有冰晶的形成。玻璃化凍存對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲(chǔ)存設(shè)備即可使用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較繁瑣的操作有關(guān)。

    目前，無(wú)論是冷凍保存理論、各種保護(hù)劑、冷凍用品和設(shè)備以及各種生物材料的保存與復(fù)蘇技術(shù)都已十分成熟和完備。

1)細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)半量換液法的應(yīng)用

    細(xì)胞復(fù)蘇的原則為快速解凍，避免冰晶重新結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑，依細(xì)胞種類(lèi)而異，一般而言大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。若要立即去除，則向解凍的細(xì)胞懸浮液加入含有5~10 mL培養(yǎng)基，離心l 000 r/min,5 min,移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后第2天更換培養(yǎng)基，以清除殘留的冷凍保護(hù)劑等對(duì)細(xì)胞的影響。

    對(duì)于一些嬌氣的細(xì)胞，生長(zhǎng)比較慢，它們自身會(huì)分泌一些生長(zhǎng)因子，如果換液使用全 量的話，會(huì)驟然改變細(xì)胞的生存環(huán)境，細(xì)胞可能因?yàn)椴荒苓m應(yīng)新的環(huán)境而導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育滯緩，甚至死亡。這樣對(duì)細(xì)胞的生存和增殖都不利，甚至可能改變細(xì)胞的一些生物學(xué)性狀：所以，換液時(shí)使用半量換法，當(dāng)?shù)诙螕Q液的時(shí)候，就可以全量換了。對(duì)于普通的腫瘤細(xì)胞，一般是換全液的，特殊情況特殊對(duì)待。

2)普通冰箱短期保存細(xì)胞的方法研究

    細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)手段，細(xì)胞凍存又是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

液氮凍存細(xì)胞是長(zhǎng)期保存細(xì)胞的傳統(tǒng)方式，但實(shí)際應(yīng)用中該方法有幾個(gè)不便：

①液氮罐通常是實(shí)驗(yàn)室的緊張資源，而且需要經(jīng)常填充液氮。研究工作經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)研究人員時(shí)間變動(dòng)、實(shí)驗(yàn)試劑購(gòu)買(mǎi)等待和研究預(yù)料外結(jié)果出現(xiàn)等，一旦疏忽未及時(shí)補(bǔ)充，導(dǎo)致研究進(jìn)展受阻，損失不可彌補(bǔ)，對(duì)實(shí)驗(yàn)造成嚴(yán)重的不良影響。

②使用液氮的便利條件不同。除了大的科研單位、院校實(shí)現(xiàn)了液氮采購(gòu)的專(zhuān)門(mén)負(fù)責(zé)人，規(guī)模小的單位則需要科研人員自己購(gòu)置。

③液氮保存細(xì)胞的成本高。所以一般的細(xì)胞研究工作需要低成本方便的保存手段。

    利用普通冰箱短期凍存培養(yǎng)細(xì)胞是一種方法。有研究資料證明，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，在生長(zhǎng)90％融合時(shí)換液，第二天棄去全部液體，加入相近培養(yǎng)液體積的細(xì)胞凍存液(含10％二甲基亞砜的細(xì)胞培養(yǎng)劑)，然后parafilm膜封口，先于冰箱中4℃下放置30 min,然后轉(zhuǎn)入-20℃凍存。細(xì)胞每過(guò)一個(gè)月同時(shí)復(fù)蘇兩瓶細(xì)胞，一瓶培養(yǎng)，一瓶進(jìn)行細(xì)胞存活檢查。凍存一個(gè)月的細(xì)胞存活率可達(dá)20％，而凍存2個(gè)月的細(xì)胞存活率不足10％。

    這種操作方式在細(xì)胞凍存時(shí)，不需要*消化和離心操作，節(jié)約資源，在簡(jiǎn)陋的條件下，為研究工作提供非常有益的幫助。當(dāng)然，這種方法也存在著局限，復(fù)蘇時(shí)間與凍存時(shí)間成正比，凍存時(shí)間不能太長(zhǎng)。

    也有利用-70℃低溫冰箱對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期保存研究資料，在長(zhǎng)達(dá)8個(gè)月的保存時(shí)間內(nèi)，復(fù)蘇細(xì)胞，細(xì)胞與液氮保存細(xì)胞復(fù)蘇效果相同。