免疫組化染色實驗操作規(guī)范

1、脫蠟：二甲苯?酒精?蒸餾水

2、內(nèi)源性過氧化物酶的消除：采用過氧化物酶的檢測系統(tǒng)，必須進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶封閉處理。如果不進(jìn)行處理，組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞會干擾染色結(jié)果的判斷。常用0.3%H2O2作用切片10分鐘，對染色結(jié)果及抗原保存都沒有影響，封閉效果比較顯著。

3、血清封閉：在加入一抗前需用二抗的正常血清進(jìn)行封閉，可以減少非特異性結(jié)合。目前使用的二步法檢測系統(tǒng)可以免去這一步驟。

4、抗體使用：已有大量的即用型抗體供實驗室使用，廠家已進(jìn)行過多次的實驗檢測，可按廠家提供的條件進(jìn)行操作。濃縮型抗體一般按照廠家提供的建議稀釋度，進(jìn)行對倍稀釋預(yù)實驗。選定*的稀釋滴度后再進(jìn)行批量實驗。染色背景深大多是抗體濃度過高所致?？贵w孵育溫度一般以常溫25℃為基準(zhǔn)或37℃30分鐘，也可4℃冰箱過夜。細(xì)胞

5、沖洗：常用的沖洗液為PBS或TBS緩沖液，要嚴(yán)格執(zhí)行沖洗步驟，防止因沖洗不凈引起的背景著色，緩沖液中加入Tween20可以增強(qiáng)沖洗效果。

6、檢測系統(tǒng)：通用的檢測系統(tǒng)有*標(biāo)記的ABC、SP、LSAB等，此類檢測系統(tǒng)較為經(jīng)濟(jì)，日前仍有不少醫(yī)院在使用。非*類檢測系統(tǒng)價錢較貴，由于不需通過*的結(jié)合，可以避免內(nèi)源性*的干擾，其特點：敏感、省時、方便、背景低。

7、顯色系統(tǒng)：由于檢測系統(tǒng)采用的是辣根過氧化物酶，因此選擇DAB（棕色）和AEC（紅色）作為酶的底物，若采用堿性磷酸酶系統(tǒng)則選擇BCIP/NBT（藍(lán)紫色），常規(guī)免疫組化顯色的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低，BCIP/NBT陽性雖鮮艷，但陽性定位不準(zhǔn)確。

8、復(fù)染：襯染步驟十分簡單，但襯染的好壞對染色zui終結(jié)果的質(zhì)量影響很大。有的選用Harris蘇木素，有的用Mayer’s蘇木素，且與DAB染色對照效果，在絕大多數(shù)實驗室中使用簡單方便。也有實驗室使用甲基綠襯染襯染，但不能經(jīng)有機(jī)溶劑，容易退色。細(xì)胞