佳和試劑-免疫親和純化技術(shù)概述

           elisa試劑盒親和層析技術(shù)是純化各種生物大分子zui有效的方法之一。zui早是將抗體作為一種結(jié)合劑用于免疫親和純化，根據(jù)其自身交連產(chǎn)生大量多聚體和不溶性基質(zhì)原理收集抗原。隨后，利用抗體與惰性的微珠共價結(jié)合。雖然這種反應(yīng)是一種簡單的結(jié)合，但抗體的許多反應(yīng)性因缺乏定位作用或抗體的過量結(jié)合而喪失。下圖顯示應(yīng)用一種定位方法成功地保證了抗體的抗原結(jié)合區(qū)能較容易與抗原接合。通過研究發(fā)現(xiàn)，抗體與蛋白A或蛋白G微珠共價連接后更容易與抗原結(jié)合。將具有良好抗原結(jié)合特性且來源廣泛的各種單克隆抗體制成免疫親和層析柱，已成為一種zui適用和有效的純化方法。

                elisa試劑盒為不同飽和度抗體與抗原的結(jié)合量，將吸附兔抗鼠Is的瓊脂糖

CL-4B微珠與50％飽和度(11ms／m1微珠)和遞增量OKT9抗體結(jié)合。100％飽和度時OKT9單抗與兔抗鼠18的比值為2：1(w／w)；100％：22mgOKT9，75％：16．5rug OKT9，50％二llmg OKT9，25％：5．5mgOKT9，10％二2．2mgOKT9／ml微珠。插入圖表示經(jīng)過SDS-PAGE之后  每個濃度點(diǎn)的抗原區(qū)帶。各數(shù)值均為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。用一種免疫介質(zhì)一步法純化膜蛋白。

    免疫親和純化具有以下特點(diǎn)：①抗體與其相應(yīng)抗原結(jié)合具有高度親和力和特異性，能大量分離天然狀態(tài)或近似天然狀態(tài)的抗原；②不是所有的抗體都適用于免疫親和純化，但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就很快速而且可靠；③可按照不同規(guī)模進(jìn)行，半天內(nèi)即可完成，而且可以獲得其他層析法不可比擬的純化效果；④經(jīng)過簡單的改進(jìn)，免疫親和法也可用于純化針對不同抗原的特異性抗體。

親合純化是一種zui有效的分離抗原的技術(shù)。雖然下述的所有實(shí)例都是以蛋白質(zhì)抗原作為研究對象，但凡是能與抗體有效結(jié)合的分子都能用這種方法進(jìn)行純化。此法相當(dāng)簡單。將抗體共價結(jié)合到一種惰性的微珠上，然后將微珠與含有抗原的溶液混合。當(dāng)抗原被微珠基質(zhì)上的抗體捕獲后，通過洗滌去除無關(guān)的抗原。然后用洗脫緩沖液處理微珠，純化的抗原被釋放，并適用于進(jìn)一步研究。如果洗脫條件掌握較好而且較溫和，釋放的抗原仍保持天然狀態(tài)。

只需簡單地改變操作程序，免疫親和純化法同樣也可以用來分離經(jīng)過初步純化的抗體。此時抗原和抗體所起的作用正好相反，抗原以共價連接到微珠上，再與抗體結(jié)合，然后通過洗脫釋放出來。

    在條件合適的情況下，應(yīng)用免疫親合純化法通常只需一次就可以達(dá)到1000—10 000倍的純化效果。使用性能特別優(yōu)良的抗體或在洗脫條件掌握相當(dāng)好時，也可以達(dá)到10 000倍以上的純化效果。

免疫親和純化可分為3個步驟

    1．將抗體與基質(zhì)共價連接。

    2．將抗原結(jié)合到抗體—微珠基質(zhì)上。

    3．抗原的洗脫。

    *步，先將單克隆抗體或經(jīng)過親和純化的多克隆抗體以共價方式吸附到固相基質(zhì)上。除特殊情況外，一般不推薦使用未經(jīng)純化的多抗，因?yàn)閺亩嗫箤游鲋舷疵摽乖浅＠щy，通常需要以適當(dāng)?shù)臈l件先使抗原變性?？贵w以共價方式連接到固相基質(zhì)上有很多不同的方案，但將抗體連接到蛋白A或蛋白G微珠上可能zui簡單。另一種有用的方法是將抗體共價連接到經(jīng)過化學(xué)修飾使其具有活性基團(tuán)的微珠上。

    抗體-微珠基質(zhì)制備好后，將抗原結(jié)合到抗體上，然后通過洗滌去除混合的大分子物質(zhì)。第三步是用較強(qiáng)的洗脫條件處理免疫復(fù)合物，破壞抗體與抗原相互作用，抗原即被釋放到洗脫液中。

    免疫親和純化習(xí)慣上分為3個步驟：①抗體親和層析柱的制備；②將抗原結(jié)合到抗體—微珠基質(zhì)上；③從層析柱上洗脫抗原。

    親和層析技術(shù)zui先是由Cuatrecasa3等人建立(1968)。