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技術(shù)文章

真菌的DNA和RNA提取方法(2)

閱讀:270發(fā)布時間:2011-7-19

二、真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液,快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次
3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min
4.氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)
5.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇,混勻,靜置約30 min
6.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃處理1h
8.用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,風(fēng)干,溶于200ul TE中,-20℃保存?zhèn)溆?/div>
DNA提取緩沖液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V),PVP和巰基乙醇使用前加入5M KAc
方法一和二,是大同小異。主要是DNA提取液配方不一樣!成本也不一樣!
 
三、真菌菌絲的總RNA的提取
1.實驗試劑
(1)RNA提取緩沖液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC處理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亞精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巰基乙醇(V/V,使用前加入)。由于在高溫滅菌條件下,Tris-HCl要和DEPC發(fā)生反應(yīng),所以配RNA提取緩沖液時直接用DEPC處理的水配制即可
(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA
(3)10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl,加1‰的DEPC過夜后,高溫滅菌
(4)3M NaAc
(5)氯仿:異戊醇(24:1)
(6)酚(pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)
(7)DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜,高溫滅菌
(8)無水乙醇;70%酒精
 
2.實驗步驟
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清。沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量
(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))
注意:提取RNA請盡量在低溫下操作,如果條件不容許,在室溫下操作的時間要盡可能的短。

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