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技術(shù)文章

真菌的DNA和RNA提取方法（1）

閱讀：226發(fā)布時間：2011-7-19

一、真菌DNA的提取（方法一）
1.實驗試劑
（1）DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS
（2）3M NaAc
（3）TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA
（4）酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇（25:24:1）
（5）氯仿:異戊醇（24:1）
（6）異丙醇
（7）無水乙醇
（8）75%乙醇
（9）RNaseA
 
2.實驗步驟
（1）取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
（2）加入4mL提取液，快速振蕩混勻
（3）加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇（24:1），渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚，可以節(jié)約成本）
（4）1000rpm，4℃，5min
（5）上清用氯仿:異戊醇（24:1）再抽提一次（10,000rpm，4℃離心5min）
（6）取上清，加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min
（7）用毛細玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次，再用無水乙醇漂洗1次，吹干，重懸于500ul TE中
（8）加入1ul RNaseA （10mg/mL），37℃處理1h
（9）用酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇（25:24:1）和氯仿:異戊醇（24:1）各抽提1次（10,000rpm，4℃離心5min）
（10）取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V體積的無水乙醇，-70℃沉淀30min以上
（11）沉淀用75%乙醇漂洗，風(fēng)干，溶于200ul TE中，-20℃保存?zhèn)溆?/div>

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