1 范 圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物性食品中*類抗生素殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛奶中*類抗生素的殘留篩選檢測(cè)。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB/ T1. 1 - 20001標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則（ ISO/ IEC Directives , Part3 , 1997 , Rules for the st ructure and draf ting of In2ternational Standards , NEQ）
中華人民共和國(guó)獸藥典二○○○年版
GB/ T 6682 - 1992分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法
N Y/ T ××××- 2001動(dòng)物源食品中獸藥殘留檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則
農(nóng)牧發(fā)[1999 ]17號(hào)動(dòng)物性食品中獸藥zui高殘留*
3 制 樣
3. 1 樣品的制備 取適量冷凍的空白或供試牛奶，于 30 ℃水浴中解凍。
3. 2 樣品的保存 - 20 ℃以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/div>
4 測(cè)定方法
4. 1 方法提要或原理 試料中殘留的*類抗生素，以嗜熱脂肪芽孢桿菌為檢定菌，采用微生物學(xué)圓紙片篩選法定性測(cè)定。當(dāng)檢定菌生長(zhǎng)時(shí)，由于產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基的顏色由紫色變?yōu)辄S色。細(xì)菌被抑制的區(qū)域，無(wú)酸產(chǎn)生，培養(yǎng)基仍為紫色。本試驗(yàn)用*酶區(qū)分耐*酶的抗生素和不耐*酶的*類抗生素。
4. 2 試劑和材料 以下所用試劑，除特別注明者外，均為分析純?cè)噭?，水為符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》二○○○年版規(guī)定的純化水。
4. 2. 1 *標(biāo)準(zhǔn)品
4. 2. 2 嗜熱脂肪芽孢桿菌 （ Baci l l us sterothermophi l us） ATCC 10149 經(jīng)斜面培養(yǎng)基（見附錄 A.1）每月傳代一次 ,置 2～8 ℃冰箱中保存。
4. 2. 3 *酶 不得少于 200 萬(wàn)單位/ mL
4. 2. 4 *
4. 2. 5 磷酸二氫鉀
4. 2. 6 胨 生化試劑
4. 2. 7 大豆蛋白胨 生化試劑
4. 2. 8 胰蛋白胨 生化試劑
4. 2. 9 牛肉浸出膏 生化試劑
4. 2. 10 葡萄糖
4. 2. 11 氯化鈉
4. 2. 12 吐溫 – 80
4. 2. 13 溴甲酚紫
4. 2. 14 瓊脂 生化試劑
4. 2. 15 菌懸液的制備 將菌種接種至斜面培養(yǎng)基上，置（55 ±2） ℃培養(yǎng) 24 h 后，接種到繁殖培養(yǎng)基（見附錄A. 2） 150 mL 中，于（55 ±2） ℃培養(yǎng)72 h ,當(dāng)有80 %芽孢形成時(shí)，停止培養(yǎng)。培養(yǎng)液5 000 r/ min離心 15 min ,棄上清液;將沉淀物懸浮于滅菌生理鹽水中，振搖，離心，棄上清液，重復(fù)洗滌3 次。將洗滌過(guò)的芽孢懸浮于滅菌生理鹽水20 mL中，置2～8℃冰箱保存，可使用6個(gè)月。
將菌種接種至斜面培養(yǎng)基上，置（55 ±2） ℃培養(yǎng)7 d后，鏡檢，應(yīng)有芽孢85 %以上。用滅菌生理鹽水7 mL將芽孢洗下，在（65 ±2）℃加熱30 min ,備用。置 2～8 ℃冰箱保存 ,可使用 3 個(gè)月。
4. 2. 16 *標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 取*標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用磷酸鹽緩沖液 （pH 8. 0） 制成1 000μg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。置2～8℃冰箱保存，有效期3 d。
4. 2. 17 磷酸鹽緩沖液（pH 8. 0） 取磷酸二氫鉀2g與*8g，加水使溶解成1 000 mL，濾過(guò)，分裝，115℃滅菌30 min。
4. 3 儀器與設(shè)備
4. 3. 1 圓濾紙片 直徑13 mm
4. 3. 2 平底雙碟 直徑約90 mm ,高16～17 mm
4. 3. 3 游標(biāo)卡尺（精度0. 02 mm）或抑菌圈測(cè)定儀
4. 3. 4 恒溫培養(yǎng)箱
4. 3. 5 微量移液器
4. 3. 6 顯微鏡
4. 3. 7 鑷子
4. 3. 8 電熱恒溫水浴鍋
4. 3. 9 分析天平 感量 0. 000 01 g
4. 3. 10 天平 感量 0. 01 g
4. 4 測(cè)定步驟
4. 4. 1 試料的制備 試料的制備包括:
———取供試樣品，作為供試試料。
———取空白樣品，作為空白試料。
———取空白樣品，將*標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成10 ng/ mL 的溶液，作為空白添加試料。
———取供試樣品適量，按每1mL計(jì)加*酶0. 10 mL ,在（37 ±2）℃培養(yǎng)30 min ,作為判定試驗(yàn)試料。
4. 4. 2 樣品處理 取試料適量，（82 ±2）℃水浴加熱 2 min ,冷卻后，作為試樣溶液，供微生物法測(cè)定。
4. 4. 3 雙碟的制備 將檢定培養(yǎng)基（見附錄 A. 3）融化 ,置水浴中冷卻至 55～64 ℃,加入菌懸液（每100 mL培養(yǎng)基加0. 6～0. 8 mL ），搖勻，吸取6. 0 mL置平皿中，使其均勻攤布，待凝固15 min后備用。
4. 4. 4 測(cè)定 每個(gè)雙碟中放置5 個(gè)圓濾紙片，每個(gè)濾紙片間距 10 mm 以上 ,用鑷子輕壓紙片，使紙片與培養(yǎng)基緊密接觸，用微量移液器分別在5個(gè)濾紙片上加空白添加試料、空白試料、磷酸鹽緩沖液（pH8. 0）、判定試驗(yàn)試料、供試試料各90μL。每個(gè)試料至少重復(fù)2個(gè)雙碟，置（55 ±2）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 h。
4. 5 結(jié)果判定 供試試料中無(wú)抑菌圈，為陰性反應(yīng)。供試試料中有大于空白添加試料的抑菌圈，但在判定試驗(yàn)試料中無(wú)抑菌圈，為含不耐*酶的*類抗生素殘留的陽(yáng)性反應(yīng)。判定試驗(yàn)試料和供試試料中有同等大小抑菌圈，為含其他抑菌物、不含不耐*酶的*類抗生素殘留的陽(yáng)性反應(yīng)。供試試料中有抑菌圈，但判定試驗(yàn)試料中的抑菌圈遠(yuǎn)小于供試試料中的抑菌圈，為既含其他抑菌物又含不耐*酶的*類抗生素殘留的陽(yáng)性
反應(yīng)。
5 檢測(cè)方法靈敏度
本方法在牛奶中的檢測(cè)限為 4μg/ kg。
附錄 A（規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基的配制
A. 1 斜面瓊脂培養(yǎng)基
胨5 g ,酵母浸膏2 g ,牛肉浸膏1 g ,氯化鈉5 g ,瓊脂15 g ,水1 000 mL。除瓊脂外，混合上述成分，調(diào)節(jié) pH值使其比zui終的pH值略高 0. 2～0. 4 ,加入瓊脂 ,加熱溶化后濾過(guò)，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7. 4 ±0. 1，分裝，115℃滅菌 30 min ,趁熱斜放使凝固成斜面。
A. 2 繁殖培養(yǎng)基
酵母浸膏 1 g ,胰蛋白胨 2 g ,葡萄糖0. 05 g ,水100 mL?；旌仙鲜龀煞?，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7. 2 ±0. 2 ,分裝 ,115℃滅菌30 min。
A. 3 檢定培養(yǎng)基
牛肉浸膏3 g ,蛋白胨5 g，胰蛋白胨1. 7 g，大豆蛋白胨 0. 3 g ，葡萄糖 5. 25 g，氯化鈉 0. 5 g，* 0. 25 g，吐溫 - 80 1 g，溴甲酚紫0. 06 g，瓊脂15 g，水 1 000 mL。混合上述成分，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7. 8 ±0. 2 ,分裝 ,115℃滅菌15 min。
會(huì)員1.png)