兔弓形蟲IgG(Tox IgG)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測定兔血清，血漿及相關(guān)液體樣本中弓形蟲IgG(Tox IgG)水平。
實(shí)驗(yàn)原理：
  本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標(biāo)本中兔弓形蟲IgG(Tox IgG)水平。用純化的弓形蟲IgG(Tox IgG)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中兔弓形蟲IgG(Tox IgG)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標(biāo)記的弓形蟲IgG(Tox IgG)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中兔弓形蟲IgG(Tox IgG)的存在與否。

試劑盒組成：
 
試劑盒組成    48孔配置    96孔配置    保存       
說明書    1份    1份           
封板膜    2片（48）    2片（96）           
密封袋    1個(gè)    1個(gè)           
酶標(biāo)包被板    1×48    1×96    2-8℃保存       
陰性對照    0.5ml×1瓶    0.5ml×1瓶    2-8℃保存       
陽性對照    0.5ml×1瓶    0.5ml×1瓶    2-8℃保存       
酶標(biāo)試劑    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存       
樣品稀釋液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存       
顯色劑A液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存       
顯色劑B液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存       
終止液    3ml×1瓶    6ml×1瓶    2-8℃保存       
濃縮洗滌液    （20ml×20倍）×1瓶    （20ml×30倍）×1瓶    2-8℃保存     

樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：
1.    編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，2.    每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不3.    加樣品及酶標(biāo)4.    試劑，5.    其余各步操作相同6.    ）
7.    加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，8.    然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)9.    板孔底部，10.    盡量不11.    觸及孔壁，12.    輕輕晃動(dòng)混勻，13.    
14.    溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
15.    配液：將30（48T的20倍16.    ）倍17.    濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備18.    用
19.    洗滌：小心揭掉封板膜，20.    棄去液體，21.    甩干，22.    每孔加滿洗滌液，23.    靜置30秒后棄去，24.    如此重復(fù)25.    5次，26.    拍干。
27.    加酶：每孔加入酶標(biāo)28.    試劑50μl，29.    空白孔除外。 
30.    溫育：操作同31.    3。
32.    洗滌：操作同33.    5。
34.    顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，35.    再加入顯色劑B 50μl，36.    輕輕震37.    蕩混勻，38.    37℃避光顯色15分鐘
39.    終止：每孔加終止液50μl，40.    終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
41.    測定：以空白空調(diào)零，42.    450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

結(jié)果判定：
  試驗(yàn)有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10
  臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
  陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為兔弓形蟲IgG(Tox IgG)陰性
  陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為兔弓形蟲IgG(Tox IgG)陽性
注意事項(xiàng)
1．操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
4．    封板膜只限一次性使用，5．    以避免交叉污染。
5．底物請避光保存。
6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時(shí)，參考波長為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。

保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個(gè)月