HiFiScript cDNA*鏈合成試劑盒說明書

HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit

HiFiScript cDNA*鏈合成試劑盒

目錄號：YJ2569

保存條件：-20℃保存。

組分說明

              Size                           25            100

              HiFiScript，200 U/μl           25 μl         100 μl

              5×RT Buffer                   120 μl        500 μl

              Primer Mix                    60 μl         240 μl

              dNTP Mix，2.5 mM Each          120 μl        500 μl

              DTT，0.1 M                     60 μl         240 μl

              RNase-Free Water               1 ml          1 ml

                本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡介

　　本產(chǎn)品是專為兩步法RT-PCR*步實驗配制的cDNA*鏈合成試劑盒。該試劑

盒中使用的HiFiScript逆轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV由來的新型逆轉(zhuǎn)錄酶，新穎突變位點大幅

提升酶的轉(zhuǎn)錄活性，  cDNA*鏈合成的效率和產(chǎn)量更高，可利用    pg級的總 RNA或

mRNA合成cDNA*鏈。點突變消除RNase  H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆

轉(zhuǎn)錄酶與RNA模板的親和力，可獲得長至12  kb的cDNA。精心優(yōu)化的RT Buffer使逆轉(zhuǎn)

錄酶應(yīng)用范圍更廣，對后續(xù)的 PCR以及定量PCR實驗兼容性高。該試劑盒配備所有逆

轉(zhuǎn)錄試劑，使用簡單方便。適用于*鏈cDNA的合成和后續(xù)的RT-PCR、RT-qPCR，

以及全長cDNA文庫的構(gòu)建等。

產(chǎn)品特點

1．的逆轉(zhuǎn)錄效率：新穎突變位點大幅提升酶活性能，獲得更高產(chǎn)量的cDNA。

2．良好的延伸能力：點突變消除RNase H活性，改善逆轉(zhuǎn)錄酶與RNA模板的親和力，

   可獲得長至12 kb的cDNA。

3．靈敏度高：可利用pg級的總RNA或mRNA模板合成cDNA*鏈。

4．使用方便：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中已配備所有逆轉(zhuǎn)錄試劑，僅需準備模板即可輕松完成逆

   轉(zhuǎn)錄。

注意事項

1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒炛械慕徊嫖廴?，建議在專門

   的區(qū)域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應(yīng)使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃，避免反復(fù)凍融。

4．若起始RNA的量小于50  ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提

   供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

使用方法

注意：1 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應(yīng)體系，如果總RNA量大于5 μg，請按比例擴大反應(yīng)體系。

 i逆轉(zhuǎn)錄操作步驟：

1．將RNA模板、Primer  Mix、dNTP  Mix、DTT、RT  Buffer、HiFiScript和RNase-Free  

   Water溶解并置于冰上備用。

2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系，總體積為20 μl。

試劑                            20 μl反應(yīng)體系             終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each               4  μl         500 μM Each

Primer Mix                         2  μl

RNA Template                       X  μl          50 pg-5μg

5×RT Buffer                        4  μl              1×

DTT，0.1 M                          2  μl            10 mM

HiFiScript，200 U/μl                1  μl

RNase-Free Water               up to 20  μl

    注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

    2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

4．42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

5．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)，或置于-20℃長期保存。

ii  若逆轉(zhuǎn)錄效率低，或RNA模板二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜、GC含量高時，建議采用以下步驟：

1．將RNA模板、Primer  Mix、dNTP  Mix、DTT、RT  Buffer、HiFiScript和RNase-Free  

   Water溶解并置于冰上備用。

2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系，總體積為13 μl。

試劑                            20 μl反應(yīng)體系             終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each               4  μl         500 μM Each

Primer Mix                         2  μl

RNA Template                       X  μl          50 pg-5μg

RNase-Free Water               up to 13  μl

3．70℃孵育10分鐘，迅速冰浴2分鐘。

4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

5．繼續(xù)向以上反應(yīng)液中加入以下試劑：

試劑               20 μl反應(yīng)體系          終濃度

5×RT Buffer           4 μl            1×

DTT，0.1 M             2 μl          10 mM

        注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提

        供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：YJ0596。

        2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。

     6．輕輕吹打混勻，42℃孵育2分鐘。

     7．加入1 μl HiFiScript（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鐘。

     8．85℃孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

     9．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于 PCR反應(yīng)和熒光定量 PCR反應(yīng)，加入量應(yīng)小于 PCR反應(yīng)體系的1/10，或置于-20℃長期保存。

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