小鼠磷脂酰肌醇三羥基激酶(PI3K)ELISA試劑盒
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說明書以人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)Elisa試劑盒為例:
兔轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGFβ2)酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定兔血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGFβ2)含量。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中TGFβ2水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被抗體的微孔中依次加入TGFβ2抗原、*化的抗兔TGFβ2抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TGFβ2呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板:一塊(96孔)
2. 標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為2,000 pg/mL,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成1,000 pg/mL,500 pg/mL ,250 pg/mL,125 pg/mL,62.5 pg/mL,31.2 pg/mL,15.6 pg/mL,其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL,臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制1,000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml 2,000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
4. 檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。
5. 檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。
6. 檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(每孔100ul),實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。
7. 檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液:1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
標(biāo)本的采集及保存
1.細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請離心后收集上清,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清:標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?,試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?span lang="EN-US">100ul,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),
3. 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。
4. 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul,
5. 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
7. 依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。
注:
1. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2.為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
3. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請于2
4. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將*的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的兔TGFβ2,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
1.洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
2.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,*使用排槍加樣。
3.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。
4.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。
6.底物請避光保存。
檢測范圍:
15.6 pg/mL -2,000 pg/mL
說明
1.試劑盒保存:-20℃(較長時間不用時);2-8℃(頻繁使用時)。
2.有效期:6個月
3.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
5.中、英文說明書可能會有不*之處,請以英文說明書為準(zhǔn)。
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