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名稱：大鼠細胞色素P4502E1（CYP2E1）ELISA試劑盒

本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!

預期應用

ELISA法定量測定大鼠組織勻漿或其它相關生物液體中CYP2E1含量。

實驗原理

用純化的CYP2E1抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加進標本或標準品、*化的CYP2E1抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*的黃色。顏色的深淺和樣品中的CYP2E1呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（ 值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1、 酶標板：一塊（96孔）

2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為20 ng/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，樣品稀釋液直接作為空缺孔 0 ng/ml。如配制10 ng/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）20 ng/ml的上述標準品加進含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。

7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。

11、覆膜：5張

12、使用說明書：1份

自備物品

1、 酶標儀（建議儀器使用條件前預熱）

2、 微量加液器及吸頭，EP管

3、 蒸餾水或往離子水，濾紙

標本的采集及保存

1、 組織勻漿：將動物的組織標本先用PBS洗滌，往除多余血液，勻漿化后放在5~10 ml PBS中于-20℃放置過夜，第二天，經(jīng)過二次反復凍融破膜，將勻漿物5000x g離心5分鐘，取上清即可檢測。

2、 其它生物標本：請1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保 存，但應避免反復凍融。

注：以上標本均應密封保存，4 保存應小于1周，-20 不應超過1個月，-80 不應超過2個月；

操縱步驟

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應猜測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。

1、 加樣：分別設空缺孔、標準孔、待測樣品孔?？杖笨准訕悠废♂屢?100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，留意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效

性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2、 棄往液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。

3、 棄往孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。

5、 棄往孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6、 每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

7、 每孔加終止溶液50 ，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加進順序應盡量與底物 液的加進順序相同。

8、 立即用酶標儀在450nm波長丈量各孔的光密度（ 值）。

注：

1、 試劑預備：所有試劑在使用前應平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操縱中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔假如太大，將會導致不同的 “預溫育”時間，從而明顯地影響到丈量值的正確性及重復性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設置復孔進行實驗。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操縱，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)；同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4、 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放進反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。

5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不正確稀 釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

6、 反應時間的控制：加進底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹舆M終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

洗板方法

1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注進孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸往（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上展墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。

2、 自動洗板：假如有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

本試劑盒可同時檢測重組或自然的大鼠CYP2E1，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

各標準品及樣本 值扣除空缺孔 值后作圖（七點圖），如設置復孔，則 應取其均勻值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標）， 值為橫坐標（對數(shù)坐標），在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回回方程式，將樣品的 值代進方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：0.312 ng/ml - 20 ng/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值：20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml。

zui低檢測限：0.078 ng/ml