（1）無(wú)菌操作：細(xì)菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的常見(jiàn)原因，必須加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的無(wú)菌操作觀念，以預(yù)防為主，一旦污染，一般很難消除。
（2）培養(yǎng)液：所用的培養(yǎng)液必須滿(mǎn)足細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的必要條件。由于細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物種類(lèi)、組織類(lèi)型不同，對(duì)培養(yǎng)液的要求有一定的差異，必要時(shí)可用預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。
（3）小牛血清：小牛血清對(duì)于維持培養(yǎng)細(xì)胞的生存和促進(jìn)細(xì)胞增殖起著關(guān)鍵性作用。可選擇多種不同批號(hào)的小牛血清進(jìn)行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號(hào)小牛血清后，就保持應(yīng)用至實(shí)驗(yàn)完成。
（4）*：必須新鮮配制，貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（即使是-20℃低溫保存），也將影響消化效力，導(dǎo)致消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞損傷增加。
（5）L-*：幾乎所有細(xì)胞對(duì)*都有較高的要求，細(xì)胞需要*合成核酸和蛋白質(zhì)，在缺少*時(shí)，細(xì)胞會(huì)因生長(zhǎng)不良而死亡。*在溶液中很不穩(wěn)定，加有*的培養(yǎng)液在4℃冰箱貯存兩周以上時(shí)，就應(yīng)重新加入原來(lái)量的*。
（6）靜置培養(yǎng)：原代細(xì)胞在消化分離后，置于CO2培養(yǎng)箱的頭24～48h （必要時(shí)72h）內(nèi)，應(yīng)處于靜置狀態(tài)，切忌不時(shí)地取出培養(yǎng)瓶觀察生長(zhǎng)狀況，這將使原代分離細(xì)胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖，初學(xué)者尤應(yīng)注意。不必?fù)?dān)心培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)消耗光，在細(xì)胞增殖之前對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細(xì)胞貼壁伸展。
（7）消化時(shí)間：一般消化至肉眼尚可見(jiàn)微小組織顆粒即可，因?yàn)榇藭r(shí)組織顆粒已經(jīng)松散，略經(jīng)吹打即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，過(guò)久的消化往往導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞培養(yǎng)成活率降低。
（8）其他生長(zhǎng)因子：經(jīng)過(guò)以上處理，一般原代分離細(xì)胞培養(yǎng)均可以成功。對(duì)于少數(shù)特殊類(lèi)型細(xì)胞也可以考慮加一些特殊的生長(zhǎng)因子，如胰島素能促使細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外，內(nèi)毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費(fèi)用較高。
