*試劑盒說明書

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*酶聯(lián)免疫反應測試盒使用說明書
一.簡介

1．試劑盒描述

*作為一種*類物質(zhì)，能抑制細菌DNA螺旋酶活性。它作為*類代表類藥物，用于由沙門氏菌、巴氏桿菌、支原體和嗜血桿菌類引起的動物傳染病。*和他的主要代謝產(chǎn)物*在肌肉組織、脂肪和牛奶中zui大殘留*100ppb。MaxSignal^TM*酶聯(lián)免疫反應測試盒為養(yǎng)殖者和政府監(jiān)督管理部門提供了低檢出限0.5 ppb的快速檢測技術。該試劑盒有以下特點：

Ø 快速10-30分鐘之內(nèi)可完成從飼料、肌肉，牛奶、組織，血清和尿液中提取*的全過程且回收率達到75-95%。

Ø 快速的檢測（在不考慮樣品數(shù)量的情況下只需不到2小時）。

Ø 高重現(xiàn)性。

2．試劑盒原理

MaxSignal^TM*酶聯(lián)免疫反應測試盒基于競爭性酶聯(lián)反應原理，含有*的抗原已經(jīng)包被于微孔板上。藥物分析時，樣品同特異性一抗共同被添加到板孔中。如果樣品中含有藥物，會競爭一抗，抑制抗體與板上包被的藥物抗原結合。加入酶標記的二抗，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物。加入底物后，產(chǎn)物的顏色強弱與樣品中藥物的濃度成反比。

3.試劑盒組成部分和儲存

（1）試劑盒包括：

已包被抗原的酶標板（Enrofloxacin-coated Plate）（可拆式）.... 12×8孔

標準液（Standards）（0，0.1，0.25，0.5，1.0，5.0 ）.............. 6×0.8mL

回收用10ppb（Spiking）（可選）................................................. 1×0.8ml

*一抗（Antibody #1）........................................................ 1×15mL

100×HRP酶標二抗（HRP-Conjugated Antibody #2）................. 1×250µL

酶標二抗稀釋液*（Antibody #2 Diluent）..................................... 1×20mL

20×濃縮洗液*（Wash Solution）.................................................... 1×28mL

終止液*（Stop Buffer）.................................................................... 1×20mL

底物*（TMB Substrate）.................................................................. 1×12mL

10×樣品提取液（Sample Extraction Buffer）................................. 1×25mL

*可以和其他BIOO產(chǎn)品的交叉使用（有效期內(nèi)）

（2）試劑盒的保存

本試劑盒應當在2-8℃的溫度下儲存，有效期為一年。如果超過3個月不使用試劑盒，請將一抗和二抗放置-20℃冷凍保存。

（3）樣品檢測下限

檢測物質(zhì)	檢測下限（ng/g）
飼料	1.0
肌肉/肝臟/腎臟/魚類/蝦	1.0
牛奶	0.5
血清	0.5
尿液	0.5
蜂蜜	2.0

（4）交叉反應數(shù)據(jù)

藥物	交叉反應%
*（Enrofloxacin）	100
*（Ciprofloxacin）	100
達氟沙星（Danofloxacin）	52
*（Norfloxacin）	10
*（Enoxacin）	9
*（Pipemidic acid）	9
*（Ofloxacin）	8
培諾沙星（Benofloxacin）	7
氟甲喹（Flumequin）	6
惡喹酸（Oxolin acid）	5
*（Nalidixic acid）	3

4．其他需要而本試劑盒未提的設備或材料

ü 酶標儀

ü 恒溫培養(yǎng)箱

ü 移液器（10、20和100mL，1mL各一支）

ü 漩渦振蕩器

ü 勻質(zhì)器

ü 多道移液器（50-300mL）

二.警告

實驗前請閱讀以下文字，以保證獲得*實驗效果。

ü 標準品中含有*，請小心使用。

ü 不要使用過期的試劑盒。

ü 不同批次的試劑盒不要混用，抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。確保二抗及二抗稀釋液正確配制。

ü 盡量保持室溫20-25℃，避免在通風口操作防止溫度過低，過熱和/或者蒸發(fā)。同樣的，不要在陽光直射下實驗，防止過熱及蒸發(fā)。在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應該鋪墊若干紙巾或者其他物料。

ü 水質(zhì)量很重要，確保使用蒸餾或者去離子水。

ü 加入樣品或者試劑到空的微孔板時，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接觸。

ü 孵育時間的計算越規(guī)范越好，保持添加標準品的一致性，先添加標準品后添加樣品。

ü 從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準品曲線質(zhì)量的風險。

ü 將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中，冷藏保存。

三. MaxSignal^TM Enrofloxacin ELISA Test Kit檢測方法

1．試劑的準備

所有的試劑在使用之前應將其回溫至室溫，并在使用試劑前搖動幾下，以保證合理的濃度。

（1）1×二抗工作液

按1：99的比例來配制酶標二抗和二抗稀釋液，配成二抗的工作液。

（2）1×工作洗液

按1：19的比例配制濃縮洗液和雙蒸餾水。

（3）1×樣品提取液

按1：9的比例配制樣品提取濃縮液和雙蒸餾水。

（4）35%乙醇/樣品提取液（用于檢測尿樣、血清、牛奶）

混合6.5體積的1×樣品提取液和3.5體積100%乙醇。

2．樣品的準備

2.1 飼料

（1） 1份樣品中加入5份70%的甲醇（如1g樣品+5mL70%甲醇），勻漿；

（2）取1.5ml勻漿樣品，室溫下（20-25℃）4000g離心5分鐘；

（3）移取0.5mL上清液，加入0.5mL1×樣品提取液，混合均勻；

（4）每孔加入50µL進行檢測。

稀釋倍數(shù)：10.0

2.2 肌肉/肝臟/腎臟/魚類/蝦

（1）去除樣品中的脂肪，取合適的勻漿器對樣品進行勻漿；

（2）取1g勻質(zhì)樣品，加入4mL70%甲醇；

（3） zui大轉速下劇烈震蕩渦旋10分鐘；

（4）室溫下4000g離心5分鐘；

（5）移取0.5mL上清液，加入0.5mL樣品提取液，混合均勻，每孔取50µL樣品用于檢測。

稀釋倍數(shù)：10.0

2.3 牛奶

（1）對于無脂牛奶，取200µL牛奶+800µL35%乙醇/樣品提取液，混勻，每孔取50µL稀釋樣品進行檢測；

（2）對于含脂牛奶，取1ml樣品，4000g離心5分鐘以去除上層脂肪層，取出200µL牛奶+800µL35%乙醇/樣品提取液，混勻，每孔取50µL稀釋樣品進行檢測。

稀釋倍數(shù)：5.0

2.4血清

（1）取0.5ml樣品，4000g離心5min

（2）取出0.2ml上清液，加入0.8ml35%甲醇/樣品提取液混合液，每孔取出50µL檢測。

稀釋倍數(shù)：5.0，根據(jù)實際需要樣品可用35%甲醇/樣品提取液混合液進一步稀釋。

2.5 尿樣

（1）取0.5mL樣品，4000g離心5分鐘；

（2）取0.2mL上清液，加入0.8mL35%乙醇/樣品提取液，每孔取50µL檢測。

稀釋倍數(shù)：5.0

2.6 蜂蜜

（1）稱取0.1g蜂蜜樣品，加入1.9ml的35%乙醇/樣品提取液混勻

（2）每孔取50ul用于檢測

稀釋倍數(shù)：20.0

3．酶聯(lián)免疫反應測試步驟

以下為計算份量的表格，用戶可根據(jù)自己的需要來確定需要配制多少試劑。

試劑	每個反應需要的體積	24次反應的體積
一抗	100 mL	2.4mL
二抗工作液	150 mL	3.6 mL
工作洗液	2 mL	48 mL
終止液	100 mL	2.4 mL
底物	100 mL	2.4 mL

（1）加入50mL的標準液或樣品于所設定的孔中；

（2）在每孔中加入100mL一抗，輕輕敲擊微孔板邊緣1分鐘；

（3）室溫（20-25℃）孵育30分鐘；

（4）洗板3次，每次應該加入250mL 1×洗液，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；

（5）每孔加入150mL 1×二抗（避免陽光直射和工作臺溫度過低，孵育時適當覆蓋微孔板）；

（6）室溫（20-25℃）孵育30分鐘；

（7）洗板3次，每次應該加入250mL，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；

（8）加入100mL的TMB底物（底物本身是無色的，出現(xiàn)顏色變化不能使用。孵育時適當覆蓋微孔板）；

（9）加入底物后立即計時，輕敲試劑盒使混勻；

（10）在室溫下培養(yǎng)15分鐘，加入100mL的終止液終止反應，在450nm下讀OD值（讀數(shù)前用無絨布擦拭微孔底部水分和指模）。

4．結果計算

（1）分別計算標準、質(zhì)控和樣品的平均吸光度值和相對吸光度值。

（2）相對吸光度值（%） = （標準或樣品吸光度值/零標準吸光度值） ´ 100

（3）以相對吸光度值為縱坐標，標準濃度為橫坐標建立標準曲線。

（4）從標準曲線上讀取質(zhì)控和樣品的濃度值。

（5）樣品檢測下限和定量下限計算方法如下:

樣品檢測下限 = （0.1ng/g） ´ （稀釋倍數(shù)）

樣品定量下限 = （0.25ng/g） ´ （稀釋倍數(shù)）

備注：如結果呈陽性反應，應該用其他檢驗方法（如色譜/質(zhì)譜方法等）進行確證。

以下曲線圖是*酶聯(lián)免疫反應檢測試劑盒典型標準曲線

四. 問題與解決

1.標準品無顏色變化或者無相應數(shù)值

可能原因	解決方法
試劑使用順序混亂，或者操作步驟出錯。	遵循實驗說明重復實驗。
使用了錯誤的抗體，或者二抗配制錯誤、失效。	確保抗體來自同一試劑盒，所有抗體不同批次之間有一定的差異，確保二抗的配制無誤。
TMB底物失效。	使用新的BIOO TMB底物。

2.低吸光度（OD值）

可能原因	解決方法
試劑過期，或者不同的批次混用。	查證過期試劑和批次。
洗液配制錯誤。	使用試劑盒提供的洗液，正確配制。
過多次洗滌。	按照說明書要求進行洗滌。
孵育時間過短。	按照說明書要求，嚴格計算好時間。
實驗室溫度過低。	保持實驗室溫度在20-25℃，不要在空調(diào)風口或者寒冷的窗戶旁進行實驗。
試劑或者微孔板溫度過低。	確保試劑或者微孔板*回溫，在實驗開始前，將試劑放置盒子外zui少1小時。
使用錯誤波長讀數(shù)，或者酶標儀失靈。	確保450nm波長讀數(shù)，檢查酶標儀。
試劑盒處于的條件。	檢查試劑盒從冰箱拿出使用的次數(shù)，檢查試劑盒是否放置溫度（過冷或者過熱）時間太長。

3.過高的背景值或吸光度（OD值）

可能原因	解決方法
使用了質(zhì)量差的水。	如果使用的水可疑，嘗試使用蒸餾水配制洗液。
底物失效。	確保加入微孔板前，底物是無色的。
洗滌不當或者洗板機洗板效果不好。	采用說明書建議的洗滌次數(shù)，每次每孔至少加入250μL洗液。檢查洗滌系統(tǒng)，排除故障。
酶標儀失靈。如果OD值讀數(shù)很高而顏色很淺，那個這是非?？赡艿那闆r。	使用校正微孔板檢查酶標儀，檢查光源。
實驗室溫度過高。	保持實驗室溫度20-25℃，避免在熱源或者陽光直射處實驗。
試劑混淆，被污染或者配制不當。	確保使用正確的試劑，準確配制，避免污染。

4.板內(nèi)差異性大

可能原因	解決方法
加入標準品，試劑和樣品的時間不一致。	確保所有試劑可用，盡可能使用多道槍加樣，加標準品，試劑和樣品途中，不能中斷。
多道槍使用不當。	校準多道槍，檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致。
洗滌系統(tǒng)出現(xiàn)故障。	檢查洗滌系統(tǒng)，保持良好運行。

5.板間差異性大

可能原因	解決方法
板與板之間孵育時間相差太大。	獨立計時，確保一致的孵育時間。
板與板之間不一致的洗滌過程。	確保相同的洗滌次數(shù)，保證洗滌系統(tǒng)正常運作。
使用移液槍不當。	檢查移液槍，確保吸取相同液量。
微孔板，試劑，標準品和樣品處于不同溫度。	確保微孔板，試劑，標準品和樣品充分回到室溫，如果試劑體積較大則需要回溫較長時間。不能用溫水浴回溫樣品。
不同批次的試劑混用，或者試劑盒過期。	注意試劑不要混用，不同的試劑盒可能顯示不同的OD值，但是相對吸光值是有很好的對比性的。通常0標準品的OD值小于0.6顯示試劑質(zhì)量下降。

6.一個或者多個標準品數(shù)據(jù)點超出曲線范圍

可能原因	解決方法
標準品添加順序混亂，或者放置于錯誤位置。	按照說明要求重復實驗，保證標準品添加正確。
標準品被污染或者與其他標準品混淆了。	改用新的標準品，按照由低濃度到高濃度的順序添加標準品。
洗滌不一致或者洗滌系統(tǒng)失靈。	遵循一如既往的洗滌方式，檢查洗滌系統(tǒng)。
加入標準品和試劑的時間不一致。	確保一切就緒，由低濃度到高濃度添加標準品并保證不被打擾，使用多道槍移液。
多道槍使用不當。	校準多道槍，檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量一致。

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