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液相色譜儀測定氨基酸的含量

閱讀:348發(fā)布時(shí)間:2012-8-6

   液相色譜儀測定氨基酸的含量
1  L--*含量的測定
1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
*樣品,甲醇, STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)UV501紫外檢測器,7725I手動(dòng)進(jìn)樣閥,N2000色譜工作站0.03%KH2PO4溶液
1.2 HPLC色譜分析條件
流動(dòng)相為0.03%KH2PO4溶液(A)-甲醇(B),線性梯度淋洗,流速1.0mL/min,柱溫 35℃,檢測波長276nm。
流動(dòng)相 時(shí)間(t/min)
 5 10 15 20
A(%) 80 90 80 70
B(%) 20 10 20 30
1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
精密稱取*標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品50mg,置100ml容量瓶中,振搖,用流動(dòng)相溶解到刻度,作為供試品溶液,另取*樣品適量,同法操作。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)直線的制作
精密稱取*標(biāo)準(zhǔn)樣品適量 ,分別稀釋制成每1ml 中含*50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液,注入液相色譜儀,以*峰面積A為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo),制作回歸標(biāo)準(zhǔn)直線。
1.5 發(fā)酵液中樣品中*含量的測定
取發(fā)酵液,稀釋配制成約 500μg/ ml 的溶液,搖勻,過濾,取25μl進(jìn)樣,在液相色譜儀下測量,記錄峰值面積,作圖。
2 L-*含量的測定
2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
L-*標(biāo)準(zhǔn)樣品,乙腈, 
STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)UV501紫外檢測器,7725I手動(dòng)進(jìn)樣閥,N2000色譜工作站,磷酸二氫銨。
PH計(jì),磷酸,
2.2  HPLC色譜分析條件
流動(dòng)相: 以磷酸二氫銨溶液 ( 稱取磷酸二氫銨1.15g, 加水800m溶解后, 用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0±0.1, 加水稀釋至 1000ml ) - 乙腈為流動(dòng)相,線性梯度淋洗; 柱溫為30℃檢測波長為206nm;進(jìn)樣量:25μl。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)直線的制作
精密稱取*標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品50mg,置100ml 容量瓶中,振搖,用流動(dòng)相溶解到刻度,作為供試品溶液,另取*樣品適量,同法操作。精密稱取*標(biāo)準(zhǔn)樣品適量 ,分別稀釋制成每1ml 中含*50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液,注入液相色譜儀,以*峰面積A為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo),制作回歸標(biāo)準(zhǔn)直線。
2.4 發(fā)酵液中樣品中*含量的測定
取發(fā)酵液,稀釋配制成約 500μg/ ml 的溶液,搖勻,過濾,取25μl 進(jìn)樣,在液相色譜儀下測量,記錄峰值面積,作圖。

3 L-*含量的測定
3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑
    乙酸銨溶液;乙腈;L-*標(biāo)準(zhǔn)樣品; 
STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng),UV501紫外檢測器,7725I手動(dòng)進(jìn)樣閥,N2000色譜工作站。
3.2 HPLC色譜分析條件
流動(dòng)相:A為0.02%mol/L乙酸銨溶液(PH=6.5):B為乙腈,線性梯度淋洗;流速: 110 mL/min ;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。
梯度洗脫表3
流動(dòng)相 時(shí)間(t/min)
 10 20 30 40 50 60
A(%) 80 60 40 40 60 80
B(%) 20 40 60 60 40 20
3.3 標(biāo)準(zhǔn)直線的制作
方法同2.2節(jié)
3.4 發(fā)酵液中樣品中*含量的測定
     方法同2.5節(jié)

4 L-*含量的測定
4.1   實(shí)驗(yàn)儀器和試劑
   L-*標(biāo)準(zhǔn)樣品;甲醇;醋酸鈉; 
STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng),UV501紫外檢測器,7725I手動(dòng)進(jìn)樣閥,N2000色譜工作站
4.2   HPLC色譜分析條件
流動(dòng)相: A為甲醇 , B為 50 mmol /L的醋酸鈉緩沖溶液;流速1 . 0 mL /min;梯度洗脫見表1,測定波長為 262 nm,柱溫為30℃。
梯度洗脫表4
流動(dòng)相                 時(shí)間(t/min)
 10 20 30 40 50 60
A(%) 30 50 80 85 100 100
B(%) 70 50 20 15 0 0
4.3   標(biāo)準(zhǔn)直線的制作
方法同2.2節(jié)
4.4   發(fā)酵液中樣品中*含量的測定
     方法同2.5節(jié)
5 回收率實(shí)驗(yàn)
  稱取*標(biāo)準(zhǔn)液50μg/ml分別稀釋0、1、2、4、6、8、10倍,每份取1ml,按標(biāo)準(zhǔn)樣品處理方法,過濾,測定標(biāo)準(zhǔn)樣品中的*的含量,計(jì)算回收率。

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