Western blot是zui常用的實(shí)驗(yàn)方法，但意義并不尋常，其結(jié)果的有無往往決定著下一步實(shí)驗(yàn)的走向。當(dāng)您辛辛苦苦地花費(fèi)近兩天時(shí)間提蛋白、電泳、轉(zhuǎn)印、雜交之后，顯色時(shí)卻得到了“白板”一塊，傷心沮喪之時(shí)，千萬不要輕言放棄！請(qǐng)務(wù)必先試試我的建議：
1. 打開冰箱，看看有沒有其他顯色試劑
2. 走進(jìn)隔壁，換換其他實(shí)驗(yàn)室的成像儀器
——也許，驚喜便這樣悄然而至，幸福就在那轉(zhuǎn)角處！
對(duì)實(shí)驗(yàn)而言，幸福各有不同，而不幸往往相似。這一切都是由于那該死的“靈敏度”！
zui初的沮喪和險(xiǎn)些的錯(cuò)過，并不*是您的過錯(cuò)。千萬別被實(shí)驗(yàn)折磨之余，再背負(fù)太多的自責(zé)，因?yàn)樵蛴泻芏唷?/font>
1. 敵人太過狡猾
您研究的對(duì)象是蛋白質(zhì)，這個(gè)敵人可不簡(jiǎn)單。其表達(dá)豐度變化跨度極大，據(jù)估計(jì)有106之巨。不僅如此，真正執(zhí)行功能的蛋白，其表達(dá)量往往極微，些許的豐度變化就能帶來生命現(xiàn)象的斗轉(zhuǎn)星移。面對(duì)這樣的復(fù)雜而狡猾的蛋白質(zhì)，我們卻罕有大規(guī)模殺傷性武器，既沒有PCR般的擴(kuò)增技術(shù)，也沒有成熟的測(cè)序方法。無奈，依靠印跡這個(gè)還算特異性好的常規(guī)武器，其殺傷力又往往受制于儀器和試劑。
2. 試劑良莠不齊
說到試劑，國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口，那叫一個(gè)林林總總，價(jià)格差別也很大。很多實(shí)驗(yàn)室老板“買得起馬，配不起鞍”，zui終選擇便宜的試劑，當(dāng)然，并不是便宜沒好貨，只是更多的時(shí)候，是一分錢一分貨。殊不知這一省，就省掉了一兩個(gè)數(shù)量級(jí)的靈敏度差異。
3. 儀器表現(xiàn)迥異
我們科研工作者，多為生物學(xué)出身，對(duì)儀器硬件、光學(xué)電學(xué)有著天然的不親近感。購(gòu)買儀器時(shí)，更是墜入了諸多參數(shù)的謎團(tuán)，面對(duì)幾十項(xiàng)不知所云的陌生數(shù)字，zui終要么是舉手投降，簡(jiǎn)單地copy了其他實(shí)驗(yàn)室的選擇；要么是眉毛胡子*，本著“一個(gè)都不能少”的原則，教條地比較每一項(xiàng)參數(shù)，zui后費(fèi)盡心力地選他個(gè)所謂的“”。殊不知，參數(shù)有主次之分，其權(quán)重各異；即便參數(shù)相當(dāng)，真真地做個(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，不同廠商的“”，也會(huì)比出個(gè)一兩個(gè)數(shù)量級(jí)的靈敏度差別。因此，選擇儀器時(shí)我個(gè)人認(rèn)同那句話，“不認(rèn)廣告，認(rèn)療效”，也就是說只看關(guān)鍵指標(biāo)，再加上實(shí)際使用效果的比較，相信錯(cuò)不了。
做蛋白的實(shí)驗(yàn)許多年，碰到過“白板”、比較過試劑，也選購(gòu)過價(jià)格不菲的儀器，有些許的感受，這里和同行們做個(gè)分享。
1 選個(gè)靈敏的試劑
常用的DAB、NBT/BCIP等比色法，操作雖簡(jiǎn)單，不需儀器或膠片成像，但靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍實(shí)在太差。用此法得到的陰性結(jié)果，還有*的余地。因此，選擇化學(xué)發(fā)光或熒光的方法。
化學(xué)發(fā)光方法是由原Amersham公司發(fā)明并引入科研的，目前已經(jīng)被廣為使用?；瘜W(xué)發(fā)光的靈敏度是比色法的100-10000倍，動(dòng)態(tài)范圍更是寬了1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。之后不同廠家在此領(lǐng)域進(jìn)行研發(fā)，經(jīng)過底物的改良和試劑的優(yōu)化，zui終在靈敏度和持續(xù)發(fā)光時(shí)間上都有了顯著的改善。選擇試劑不僅可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)的靈敏度，還可使一抗的使用量降低到原來的1/20。因此，在選擇試劑的時(shí)候，要視情況而定，對(duì)靈敏度要求不高時(shí)，選用常規(guī)的試劑，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠；但如果蛋白豐度低、一抗又極其珍貴，那就得毫不吝惜地選擇試劑，要知道有時(shí)一抗是資源，那可是拿錢買不來的。
圖1：
如果再“不差錢”，還可以選擇熒光，來他個(gè)彩色Western。結(jié)果好看在其次，關(guān)鍵是省事兒，目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的雜交同時(shí)完成、成像一步到位。當(dāng)然這是要付出經(jīng)濟(jì)代價(jià)的，熒光試劑可比ECL試劑貴不少。
2 選個(gè)可靠的儀器
隨著CCD的發(fā)展，數(shù)碼相機(jī)已經(jīng)走進(jìn)了每個(gè)人的生活，其便捷性已經(jīng)促使我們告別了膠片時(shí)代。實(shí)驗(yàn)室也一樣，做Western不用再費(fèi)事地配顯影液，不用在暗室小心地?cái)[弄曝光夾。CCD成像儀便可讓一切變輕松，無需摸索曝光時(shí)間，只需把膜往里一扔，設(shè)定好時(shí)間間隔，儀器自動(dòng)得到不同累計(jì)時(shí)間的圖像。我們要做的只是輕松地對(duì)著電腦，選擇一張不明不暗、長(zhǎng)相漂亮的圖像就ok啦。
這事說著挺美，但是也得選個(gè)可靠的儀器才能實(shí)現(xiàn)，其中也有不少學(xué)問。這里先跟大家解釋幾個(gè)概念和參數(shù)：
何為CCD？
CCD可是個(gè)關(guān)鍵部件，沒有它根本就不會(huì)有今天的數(shù)碼成像。CCD的全名叫“Charge Coupled Device”，說白了就是光信號(hào)的接收器，它能把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，zui終變?yōu)槲覀償?shù)字化的圖像。它的大小直接決定了圖像的zui高分辨率，也就是我們常說的幾百萬像素。CCD可是個(gè)值錢的部件，面積大一點(diǎn)，價(jià)格沒準(zhǔn)會(huì)翻一番。
CCD在成像儀中是非常重要的組成部分，在這個(gè)小小的器件上也有很大的技術(shù)革新，如讓CCD像素做45度角的旋轉(zhuǎn)，以便獲得分辨率更好的圖像等等。這類問題太專業(yè)，不是我們輕易可以理解的。因此在這個(gè)問題是，我的建議是“不求弄懂，只抓主流”，也就是認(rèn)準(zhǔn)的主流品牌，選擇有研發(fā)和生產(chǎn)CCD能力的一線廠商的成像儀，如Fuji、Kodak。道理很簡(jiǎn)單，自己給自己用的東西，肯定是質(zhì)量又好又便宜。
何為冷CCD？
實(shí)驗(yàn)室用相機(jī)與家用相機(jī)不同，用到的是冷CCD，也就是說需要給CCD降溫到零下二三十度。這是為什么？原因有二，一是生物樣本的發(fā)光量實(shí)在太少，信號(hào)太微弱，需要相對(duì)長(zhǎng)的曝光時(shí)間；二是CCD等光電器件，都有不可避免的系統(tǒng)噪音，一旦曝光時(shí)間長(zhǎng)，噪音累計(jì)起來，積少成多，會(huì)對(duì)本就微弱的樣品信號(hào)造成干擾。而給CCD降溫后，其系統(tǒng)噪音可大大降低。
何為 f 值？
對(duì)這個(gè)參數(shù)的深刻認(rèn)識(shí)，得益于一次采購(gòu)Canon單反鏡頭，同一系列f1.2、f1.4、f1.8的鏡頭，價(jià)格分別是人民幣14000、2500、700，這期間的巨大差別，當(dāng)時(shí)是“雷到”我了。回來后好好研究，才了解到這是一個(gè)表征鏡頭光圈大小的指標(biāo)，f值越小則鏡頭光圈越大，也就是說單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)光量越大，鏡頭進(jìn)光量與f值的平方成反。舉個(gè)例子，f1.2與f1.8，雖然f值只小了0.6，但是進(jìn)光量面積卻增加了一倍！（如圖2） 所以千萬別小看了這個(gè)參數(shù)，它極大地影響著成像的速度和質(zhì)量，怪不得不同參數(shù)的鏡頭價(jià)格，一個(gè)天上、一個(gè)地下。
圖2：
話說遠(yuǎn)了，回到成像儀上來。成像設(shè)備，鏡頭無疑是zui重要的部件，而鏡頭的諸多參數(shù)中我認(rèn)為這個(gè)zui重要。因?yàn)閯偛盼覀冋f到過，生物樣本發(fā)光量低，為了能夠檢測(cè)到清晰的樣品信號(hào)，我們連微小的系統(tǒng)噪音都得靠低溫嚴(yán)加控制，那么對(duì)于zui關(guān)鍵的采集信號(hào)的光學(xué)部件，這個(gè)參數(shù)的考量絕不能含糊！據(jù)我所知，目前化學(xué)發(fā)光成像儀zui大的鏡頭是f 0.85，對(duì)于這種常用設(shè)備，千萬別忽視了這個(gè)參數(shù)，否則發(fā)生之前提到的不幸一幕就不足為奇了。
綜上所述，儀器一定要重視關(guān)鍵指標(biāo)，試劑要低端擇情選，不能“參數(shù)”漸欲迷人眼，“價(jià)格”障目不見山。zui后，祝愿大家的Western實(shí)驗(yàn)都能獲得漂亮的可喜的結(jié)果。
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