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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：1306發(fā)布時間：2012-8-22
觀測RNA可為研究人員帶來許多新的認識。存在于特殊細胞以及這些細胞特殊位點中的RNA可以揭示潛藏在差別背后的機制。在癌癥和其他疾病中，RNA轉(zhuǎn)錄物有時會被發(fā)現(xiàn)存在于錯誤的地方。“這就是為什么大家會對RNA的定位感興趣的原因，然而RNA成像一直是一個挑戰(zhàn)，”威爾康乃爾醫(yī)學院從事RNA調(diào)控研究的Samie Jaffrey說。
在過去的12個月里，RNA顯像能力解答了關(guān)于流感病毒如果包裝其基因這一長達半世紀之久的爭辯，幫助揭示了H1N1 RNA是如何深入穿透肺組織的，揭露了令人驚訝的剪接動態(tài)，證實了RNA轉(zhuǎn)錄物上的啟動子調(diào)節(jié)了轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，證明了神經(jīng)元mRNA借助單個的顆粒運輸?shù)搅藰渫恢?。Jaffrey說成像對于其他方式很難研究的調(diào)控性RNAs尤其重要，“了解非編碼RNA的定位有可能幫助我們了解它們的功能。”
生物化學、成像和標記的進步正在不斷擴展研究人員能夠在單個細胞中觀測RNA的途徑?？煽?、方便的試劑現(xiàn)在可在市場上購買到，用于在各種情況下標記固定細胞中的RNA。在活細胞中研究RNA轉(zhuǎn)錄物的技術(shù)更具挑戰(zhàn)性，但它們也在不斷擴展和改良。
RNA FISH在固定細胞中發(fā)現(xiàn)單分子
原位雜交（FISH）是通過利用附著熒光染料或其他標記物的互補寡核苷酸組成的轉(zhuǎn)錄物特異性探針來揭示RNA。報道RNA熒光原位雜交是在上世紀80年代，其操作困難且應用有限。然而這一曾經(jīng)了不起的藝術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成為了一種方便的技術(shù)。
如果某些商家的希望被實現(xiàn)，在細胞內(nèi)成像RNA轉(zhuǎn)錄物將成為像蛋白質(zhì)免疫染色一樣的常規(guī)的技術(shù)。臨床診斷公司Advanced Cell Diagnostics的執(zhí)行官Yuling Luo說在基于抗體的蛋白質(zhì)標記存在問題的地方RNA標記有可能實現(xiàn)。他解釋說因為有可能無法獲得適合的抗體，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或定位有可能阻礙標記或是標記一種蛋白的條件或許不適于標記另一種。相反，*不同蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物都可以在相同的分析條件下進行檢測。Luo和其他人希望將RNA轉(zhuǎn)錄物作為生物標記的應用將不斷增多。
RNA成像也可以解答基因表達譜研究提出的一些問題。曾經(jīng)科學家們追蹤過一些轉(zhuǎn)錄物開展進一步的研究。RNA原位雜交可以顯示基因如何在整個細胞群中表達，在同一個細胞中哪一對轉(zhuǎn)錄物一起增高和下降，一種轉(zhuǎn)錄物是否定位在特異的細胞類型中或是像樹突這樣的特殊區(qū)室內(nèi)。原位雜交還可以證實RNA干擾研究中一種轉(zhuǎn)錄物是否確實受到了抑制。
麻省理工學院和Hubrecht 研究所系統(tǒng)生物學家Alexander van Oudenaarden 說RNA FISH研究的一個巨大推動力就是越來越多的人對細胞所包含的驚人的異質(zhì)性感興趣。“如果你忽視細胞的個體性，在一根試管中將它們混合到一起，你zui終獲得的將是實際上不存在的平均個體。”他提供了一個可口的比喻：只是品嘗沙沒有人能夠?qū)W會區(qū)分芒果、香蕉或草莓不同的口味。相鄰的細胞可能剛好不同，檢測它們需要分辨單細胞基因表達。
van Oudenaarden利用RNA FISH在小鼠腸冰凍切片上顯示了作為三種類型干細胞標記的轉(zhuǎn)錄物在隱窩中的分布。腸隱窩常被用于研究再生和分化。利用原位RNA，可以快速挑選出大量的標記物，組合觀測它們看看哪些*地識別了不同的細胞類型;用熒光蛋白標記完成同樣的事情將是不太可能或不切實際的。van Oudenaarden.說：“無需遺傳修飾任何東西，你就可能獲得大量的進展。這相當?shù)娜菀?。我們開玩笑說我們甚至不是生物化學家。”他說難的是設計成像系統(tǒng)和相應的軟件。
*個普遍應用的RNA FISH探針是利用質(zhì)粒來生成反義RNA，其摻入的修飾核苷酸結(jié)合到了隨后可以被標記的抗體上。阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學院的Robert Singer實驗室構(gòu)建出了另一種方法，用酶將熒光核苷酸類似物摻入到長雙鏈DNA分子。他們后來改良了這一技術(shù)利用幾組更小的合成DNA探針，每種探針大約50個核苷酸長，標記著一些小分子熒光基團。
Tyagi說利用更短的、逐個衍生的探針在固定細胞中生成RNA標記更易于處理。“這是一個簡單的步驟可以解決大問題。由于寡核苷酸合成已經(jīng)變?yōu)樽詣踊憧梢栽?6孔板中生成寡核苷酸。”他補充說更多更小的探針提供了其他的利益。例如，一種探針的結(jié)合松解了轉(zhuǎn)錄物使得其他的探針更易于結(jié)合。并且并不是每個探針都需要是的，“你得到的是所有或大多數(shù)探針結(jié)合的信號，非不是一個或兩個錯誤結(jié)合的信號。”
Biosearch Technologies公司在去年9月推出了短的逐個標記的探針Slaris FISH。在研究人員在線輸入他們需要的轉(zhuǎn)錄物的序列后，公司的軟件會設計出數(shù)組多達48種探針來標記它。Biosearch提供8種熒光基團選擇，從藍色到紅色，研究人員也可以購買為標記的衍生探針，自己添加熒光基團。例如，van Oudenaarden將特異的基團附著到了波譜的紅色端，從而可以與藍色的核及綠色標記的蛋白一并成像。Tyagi在同一套探針內(nèi)利用兩種不同的基團檢測了RNA加工事件，例如選擇性剪接形式。相似的方法可以鑒別融合基因。
這種方法被van Oudenaarden'的前博士后Arjun Raj進一步改良，他和新澤西醫(yī)學與牙科大學的Sanjay Tyagi設計出了更短的用于RNA FISH的寡核苷酸。這一系統(tǒng)利用數(shù)組約50種左右的探針，每種靶向轉(zhuǎn)錄物不同的部分。這些探針大約20個核苷酸長，用單個熒光基團修飾，更易于穿透細胞，相比于長探針制造更便宜更快速。然而，這種策略不能靶向短于約800個核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，因為較少標記的轉(zhuǎn)錄物很難看見。
Biosearch Technologies 公司企業(yè)發(fā)展部主任Marc Beal 說5納摩爾的混合定制寡核苷酸的標準定價為575美元，足夠進行500-2000次反應。Beal說該系統(tǒng)可以與各種熒光顯微鏡包括廣野顯微鏡和共聚焦顯微鏡一起使用，可用于冰凍、石蠟包埋組織樣品以及培養(yǎng)細胞。采用油浸透鏡可將“RNA點”放大60-100倍。Biosearch也正在開發(fā)一種可自動分析的成像系統(tǒng)。
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