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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：333發(fā)布時間：2011-9-20
抗酶抗體的優(yōu)點(diǎn)，在于酶和抗體結(jié)合時，不需要通過化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)，抗體的失活少。在酶復(fù)合物形成后，同時就具有酶的活性，遇到相應(yīng)的底物即呈現(xiàn)催化顯色作用。必須注意，抗酶抗體必須用與*抗體同種來源的動物制備。
（一）抗酶抗體的制備
于家兔的兩個后足掌內(nèi)各注入弗氏*佐劑（含活卡介苗12mg/ml）和過氧化物（5mg/ml）
的等量混合乳化液0.5ml，兩星期后，于兩側(cè)腘淋巴結(jié)內(nèi)注入同樣液體。一周后靜脈注射0.2ml~0.4ml，過氧化物酶液（同樣濃度）, 并同樣強(qiáng)化2－3次,末次注射后一周驗(yàn)血、分離血清即為過氧化物酶抗體。
（二）酶－抗酶復(fù)合物（PAP）的制備
1．取單價特異性抗酶血清10ml，1.5×104r/min（4℃）離心20min，吸取上清。
2．于上清液中滴加酶溶液（0.5mg/ml）直至不再產(chǎn)生沉淀,靜置1h，1.5×104r/min離心20min。
3．將沉淀物用冷生理鹽水125ml洗三次，每次1.5×104r/min離心20min。
4．于冰浴下，將沉淀物懸混于4ml HRP（2mg/ml）中。
5．在pH計(jì)監(jiān)測下，邊攪拌邊加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此時沉淀已全部溶解，1.5×104r/min離心20min。
6．吸取上清，用0.1Mol/L NaOH調(diào)pH至7.4。
7．量體積，加入1/10容量的0.075Mol/L醋酸鈉和0.15Mol/L醋酸銨的等量混合液。
8．逐滴加入等體積的100%飽和硫酸銨，攪拌20min。1.5×104r/min離心20min。
9．將沉淀物用50%飽和硫酸銨洗1次，同樣離心。
10．將沉淀物懸混于5ml蒸餾水中，以pH6.75緩沖鹽水透析3天，每天換水1次。（緩沖鹽水由1.35×104ml生理鹽水, 25ml 1.5Mol/L醋酸鈉和75ml 2Mol/L醋酸銨配成）。
11．1.5×104r/min（4℃）離心20min，吸取上清，于OD280nm和OD403nm測定,計(jì)算IgG和酶含量及克分子比值。
12．按0.1ml分裝，-20℃保存。
13．應(yīng)用時從低溫冰箱中取出,立即在37℃水浴中融化。
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