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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：635發(fā)布時(shí)間：2010-11-3
1） 細(xì)胞準(zhǔn)備。
對(duì)單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm，5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。
（2） 固定。
根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min。
（3） 通透。
使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3×5 min。
（4） 封閉。
使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min。
（5） 一抗結(jié)合。
室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。
（6） 二抗結(jié)合。
間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。
滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
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