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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：1763發(fā)布時(shí)間：2010-4-28
液相色譜柱（HPLC）及相關(guān)方法
HPLC是一種比較傳統(tǒng)的方法，能夠定量測(cè)定基因組整體水平DNA甲基化水平。它由Kuo等1980年[18]報(bào)道。過(guò)程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過(guò)色譜柱，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光測(cè)定吸收峰值及其量，計(jì)算5mC/（5mC 5C）的積分面積就得到基因組整體的甲基化水平。這是一種檢測(cè)DNA甲基化的標(biāo)準(zhǔn)方法。但它需要較精密的儀器。Fraga等2002年[19]運(yùn)用毛細(xì)管電泳法（HPCE）處理DNA水解產(chǎn)物，以確定5mC的水平。與HPLC相比，HPCE更加簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)。HPLC及HPCE測(cè)定基因組整體DNA甲基化水平的敏感性均較高。Oefner等1992年[20]提出變性液相色譜法（DHPLC）用于分析單核苷酸和DNA分子。鄧大君等2001[21]將其改進(jìn)與PCR聯(lián)用建立了一種檢測(cè)甲基化程度的DHPLC分析方法。將重亞硫酸鹽處理后的產(chǎn)物進(jìn)行差異性擴(kuò)增，由于原甲基化的在重亞硫酸鹽處理時(shí)仍被保留為胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR擴(kuò)增時(shí)，其變性溫度也相應(yīng)上升，使PCR產(chǎn)物在色譜柱中保留的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，這樣就可以測(cè)定出PCR產(chǎn)物中甲基化的情況。
這種方法的zui明顯優(yōu)點(diǎn)是：可用于高通量混合樣本檢測(cè)，能夠明確顯示目的片段中所有CpG位點(diǎn)甲基化的情況，但不能對(duì)甲基化的CpG位點(diǎn)進(jìn)行定位。
2.1.2SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法[22]
SssI甲基轉(zhuǎn)移酶能夠催化DNA的CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化。3H-S-腺苷*（3H-SAM）在SssI甲基轉(zhuǎn)移酶催化作用使基因組DNA的CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化。通過(guò)測(cè)定剩余的放射性標(biāo)記的SAM即可得到原基因組整體甲基化水平，即測(cè)到的放射性強(qiáng)度與所測(cè)DNA甲基化水平成反比。這種方法的缺點(diǎn)是所使用的SssI甲基轉(zhuǎn)移酶不穩(wěn)定，致結(jié)果不夠。
2.1.3免疫化學(xué)法[23]
這種方法是基于單克隆抗體能夠與5mC發(fā)生特異性反應(yīng)。應(yīng)用熒光素標(biāo)記抗體使之與預(yù)先已固定在DEAE膜上的樣品DNA特異性結(jié)合，對(duì)DEAE膜上的熒光素進(jìn)行掃描得到5mC的水平，其熒光素強(qiáng)度與5mC水平成正比。Oakeley等1997年[23]報(bào)道了這種方法。這種方法需要精密的儀器。
2.1.4氯乙醛法
Oakeley等1999年[24]首先描述了這種使用氯乙醛和熒光標(biāo)記的方法。首先，將DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理使未甲基化的胞嘧啶全部轉(zhuǎn)變?yōu)?，而甲基化的胞嘧啶保持不變（Frommer等1992年）[25]，然后經(jīng)過(guò)銀或色譜柱去除DNA鏈上的嘌呤，再將樣品與氯乙醛共同孵育，這樣5mC就轉(zhuǎn)變?yōu)閹в袕?qiáng)熒光的乙烯胞嘧啶，熒光的強(qiáng)度與原5mC的水平成正比。這種方法可以直接測(cè)定基因組整體5mC水平。其優(yōu)點(diǎn)是所用試劑價(jià)格低廉且穩(wěn)定性好，避免了放射性污染，但缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且氯乙醛是一種有毒的物質(zhì)。
2.2特異性位點(diǎn)的DNA甲基化的檢測(cè)
2.2.1甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶（methylation-sensitiverestrictionEndonuclease，MS-RE）-PCR/Southern法
這種方法利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化區(qū)的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進(jìn)行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶有HpaⅡ-MspⅠ（識(shí)別序列CCGG）和SmaⅠ-Xmal（CCCGGG）等。由于后者識(shí)別的堿基數(shù)相對(duì)較多，其堿基序列在體內(nèi)出現(xiàn)的概率相對(duì)較低，所以以前者即HpaⅡ-MspⅠ更常用。其中HpaⅡ和MspⅠ均能識(shí)別CCGG序列，然而當(dāng)序列中的胞嘧啶發(fā)生甲基化時(shí)，HpaⅡ不切割，利用HpaⅡ-MspⅠ的這種屬性處理DNA，隨后進(jìn)行Southern或PCR擴(kuò)增分離產(chǎn)物，明確甲基化狀態(tài)[12][26]。
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