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廣西大學文章：改進染色質(zhì)免疫共沉淀方法
點擊次數(shù)：791 發(fā)布時間：2014-12-4
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生物通報道：作為研究基因表達調(diào)控的重要方法，近年來染色質(zhì)免疫共沉淀得到了越來越廣泛的應(yīng)用，但有關(guān)將乳腺組織作為ChIP材料的研究及其方法尚未見報道。
近期來自廣西大學亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室等處的研究人員提出了一種新型乳腺組織染色質(zhì)免疫共沉淀方法，這種方法獲得的DNA樣品中， 靶序列得到顯著的富集， 所得的DNA樣品能夠滿足測序（ChIP Seq） 要求。結(jié)果說明， 改進后的方法適用于乳腺組織染色質(zhì)免疫共沉淀， 并為研究乳腺組織基因表達調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
基因的表達受到多種轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)蛋白的調(diào)控， 基因表達調(diào)控常用研究方法包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合實驗、 電泳遷移阻滯實驗、 酵母單雜交系統(tǒng)和染色質(zhì)免疫共沉 淀 技 術(shù)。盡管這4種方法均可以鑒定轉(zhuǎn)錄因子在DNA 中的結(jié)合位點， 但前3種方法需要將DNA與轉(zhuǎn)錄因子分離到體外進行實驗， 無法真實地反映在不同生理狀態(tài)下， 轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)靶基因識別與結(jié)合的真實情況。
ChIP技術(shù)通過甲醛交聯(lián)， 將某一時刻DNA與轉(zhuǎn)錄因子之間的作用情況“ 快照” 下來， 可真實、 完整地反映特定時刻下， 目的蛋白在全基因組序列中的結(jié)合情況， 因此，近年來該技術(shù)得到越來越廣泛的應(yīng)用。ChIP研究多以細胞系或從組織分離培養(yǎng)所得的細胞為材料， 但離體培養(yǎng)的細胞無法*模擬體內(nèi)細胞相應(yīng)的生理狀態(tài)， 無法排除細胞培養(yǎng)過程中對基因表達及其調(diào)控產(chǎn)生的影響。已有直接將組織作為
ChIP材料、 避免細胞培養(yǎng)可能產(chǎn)生的潛在影響的報道。目前有關(guān)組織ChIP方法遠不及以細胞 ChIP方法成熟， 相關(guān)研究報道也較少， 同時急需進一步研究完善適合不同組織的ChIP方法。
ChIP技術(shù)通過甲醛交聯(lián)固定結(jié)合在染色質(zhì)上的蛋白， 經(jīng)細胞裂解、 染色質(zhì)斷裂， 用結(jié)合有相應(yīng)抗體的沉降珠捕獲并分離目的蛋白DNA復合物， zui后經(jīng)反交聯(lián)、 純化后， 得到與目的蛋白結(jié)合的 DNA片段。目前大多數(shù)利用 ChIP技術(shù)對DNA與蛋白之間相互作用進
行的研究均是以細胞為材料， 將活體組織作為ChIP材料的報道較少， 尚未有以乳腺組織為 ChIP材料的報道。與脾臟等組織不同， 乳腺組織中含有大量乳腺纖維， 致使樣品均一化處理時難以分離得到呈單一狀分布的細胞， 且細胞容易破損， 回收率低。泌乳期乳腺細胞裂解后， 裂解液中含有大量的乳脂和乳蛋白， 嚴重影響雜交效率。超聲法斷裂染色質(zhì)過程中易產(chǎn)生積熱、 易導致反交聯(lián)和蛋白質(zhì)變性， 因此對超聲波儀的溫控要求較高。
針對以上問題， 研究人員以Stat為目的蛋白對傳統(tǒng)的組織染色質(zhì)免疫共沉淀方法進行了改進， 尋找適合乳腺組織的染色質(zhì)免疫共沉淀方法。
研究人員省略組織均一化步驟、 用酶切 超聲法代替超聲法進行染色質(zhì)片段化、 在細胞裂解和酶切步驟間增加洗滌步驟。結(jié)果顯示， 與脾臟組織相比， 乳腺組織不適合進行組織均一化處理。酶切 超聲法比超聲法更適于對乳腺組織進行染色質(zhì)片段化。采用改進后的 ChIP方法獲得的DNA樣品中， 靶序列得到顯著的富集， 所得的DNA樣品能夠滿足測序（ChIP Seq） 要求。結(jié)果說明， 改進后的方法適用于乳腺組織染色質(zhì)免疫共沉淀。
研究人員認為，利用改進后的方法， 將乳腺組織經(jīng)抗體與磁珠耦合、 組織處理、 交聯(lián)、 酶切 超聲裂解、 孵育、洗滌、 反交聯(lián)和純化共8步處理后， 經(jīng)QPCR方法證實， 得到了富集有 Stat靶序列片段的DNA片段， 且樣品質(zhì)量達到華大公司對ChIP樣品的測序要求。測序分析結(jié)果顯示， 利用改進后的ChiP方法獲得的樣品數(shù)據(jù)背景干凈、 峰形顯著、 重復性高， 可滿足ChIP Seq要求。
這些結(jié)果說明， 改進后的方法適用于乳腺組織染色質(zhì)免疫共沉淀， 該方法為研究乳腺基因表達調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。