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公司動(dòng)態(tài)

利用血清篩選噬菌體文庫(kù)的篩選

閱讀：453發(fā)布時(shí)間：2010-8-2

[器材和試劑]
● PBBST（PBS，0．1％BSA，0．1％Tween-20）
● 磁分離儀（Dynal）
● f1Rl紫外滅活噬菌體
● 洗脫緩沖液（用*將0．1mol/L HCl調(diào)整到pH 2．2，1mg/mlBSA）
● 2rn01/L Tris-HCl pH 9．0
● LB-瓊脂培養(yǎng)基（1％細(xì)菌用胰蛋白胨，0．5％酵母提取物，1．5％細(xì)菌用瓊脂，0．17Trl01/L NaCl，pH 7．2）
● LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG[LB-瓊脂培養(yǎng)基，50/xg/m1*，35ug/ml X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷），35p．g/m11PTG（異丙基硫代半乳糖苷）]

[方法]
1．將已包被的磁珠轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，加入50ul血清樣品PBBST液，zui后定容至1m1。4℃轉(zhuǎn)輪孵育12～16小時(shí)。
2．在4℃下，用PBBST洗滌磁珠4次，每次30分鐘；每次洗滌10ml。
3．再次將磁珠懸浮在PBBST中， 內(nèi)含1×1013個(gè)UV滅活nRl，終體積為1ml。4℃置于轉(zhuǎn)輪上3～4小時(shí)。
4．在上述混合物中加入2X10”個(gè)文庫(kù)噬菌體顆粒，4℃溫和攪動(dòng)12～16小時(shí)。
5．在4℃下，用10m1PBBST洗滌磁珠6～7次，除去未連接的噬菌體；每次洗滌后，用磁分離儀除去液體。
6．室溫下，用0．5ml洗脫緩沖液溫和攪動(dòng)孵育磁珠30分鐘，洗脫結(jié)合噬菌體。
7．將洗脫產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中，再加入50ul的2rll01/L Tris-HCl，pH 9．0，中和。
8．在LB-瓊脂培養(yǎng)基+Amp/X-gal/IPTG平板上，按轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU）滴定洗脫噬菌體（A）和未吸附噬菌體（N）。

 


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