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核酸雜交技術(shù)

閱讀:525發(fā)布時間:2011-7-23

核酸雜交技術(shù)是較早的應(yīng)用于病原微生物的檢測技術(shù)。因其操作步驟比較煩瑣,現(xiàn)在在動物檢驗(yàn)檢疫中應(yīng)用較少,但是它是其他一些核酸檢測技術(shù)的基礎(chǔ)。它的基本步驟如下。
首先,制備一段寡核苷酸,其序列對應(yīng)于被測病原微生物某段特異性核酸序列,在此寡核苷酸上進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記,作為檢測用探針。

然后,從樣品中提取核酸,對此核酸進(jìn)行變性處理后固定在固相載體上,這些核酸變性處理后多數(shù)以單鏈的形式存在,因此它們能夠利用堿基互補(bǔ)原理,結(jié)合并固定探針,由于借助探針上標(biāo)記的物質(zhì)可以了解到是否有探針,甚至有多少探針被固定上去,再由此推知樣品中是否含有及甚至含有多少病原微生物。

上述是zui常用的固相雜交大致過程,除此之外還有液相雜交以及用于研究的細(xì)胞內(nèi)定位(原位)雜交模式。新近發(fā)展的核酸芯片技術(shù)實(shí)際上也是一類核酸雜交技術(shù)。

就固相雜交而言,又可分為斑點(diǎn)雜交和凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交。斑點(diǎn)雜交是直接將標(biāo)本點(diǎn)在固相載體上雜交,該法迅速簡單,一次可檢測大量標(biāo)本;凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交是電泳技術(shù)和雜交技術(shù)結(jié)合的一種方法,根據(jù)雜交核酸的不同,又可分為Southern印跡法(檢測DNA)及Northern印跡法(檢測RNA)。傳統(tǒng)的固相載體多應(yīng)用硝酸纖維膜和尼龍膜,近年來發(fā)展的微孔板包被技術(shù)以微孔板為載體取得了良好的效果。

探針標(biāo)記物有放射性核素與非放射性物質(zhì)兩種。放射性核素標(biāo)記敏感性高,可檢測出pg水平的核酸,但因不易長期保存,且存在放射性污染等問題,現(xiàn)已較少應(yīng)用。非放射性物質(zhì)常用的有*、地高辛等,非放射性探針安全、穩(wěn)定、操作方便并且經(jīng)濟(jì),但敏感性較低,近年來,由于雜交信號檢測方法的改進(jìn),檢測的敏感性得到了很大提高。


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