CRISPR/Cas已成為強(qiáng)有力的基因組編輯技術(shù)，并已成功地應(yīng)用于許多生物，其中包括幾個(gè)植物物種。然而，在植物中，基因組編輯試劑載體的傳遞仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。zui近，來(lái)自清華大學(xué)和中科院微生物研究所的研究人員，在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，報(bào)道了一個(gè)基于病毒的引導(dǎo)RNA（gRNA）傳遞系統(tǒng)，用于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的植物基因組編輯（VIGE），可以用來(lái)地靶定基因組位置，并引發(fā)突變。
本文通訊作者是清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的劉玉樂(lè)教授。劉玉樂(lè)教授1988年畢業(yè)于南開(kāi)大學(xué)，1992年在中科院微生物研究所獲碩士學(xué)位，1997年，獲中科院微生物研究所與英國(guó)蘇格蘭作物研究所聯(lián)合培養(yǎng)博士，曾在英國(guó)蘇格蘭作物研究所、美國(guó)德克薩斯大學(xué)奧斯丁分校、美國(guó)耶魯大學(xué)做過(guò)訪問(wèn)學(xué)者、博士后和Associate Research Scientist，2007年至今為清華大學(xué)教授，“百人計(jì)劃"責(zé)任教授，博士生導(dǎo)師，國(guó)家杰出青年基金獲得者。研究方向?yàn)橹参锩庖叩男盘?hào)傳導(dǎo)與調(diào)控、植物病毒病理的分子基礎(chǔ)、植物細(xì)胞自噬、植物功能基因組。研究成果多次發(fā)表在Plant Physiology、PLoS Pathogens、Plant Cell、Molecular Plant、New Phytologist、Journal of Biological Chemistry、Developmental Cell等學(xué)術(shù)期刊。
基因組修飾是植物遺傳學(xué)研究的核心和關(guān)鍵步驟，這可以通過(guò)隨機(jī)和靶向（位點(diǎn)特異性）誘變完成。雖然目前有很多生成隨機(jī)基因突變的工具，如通過(guò)誘變劑的化學(xué)誘變、通過(guò)快中子輻照的物理誘變、γ射線或X射線，以及在植物中通過(guò)轉(zhuǎn)座子或T-DNA的生物誘變，但是，我們很難將所需的突變與隨機(jī)突變區(qū)分開(kāi)來(lái)。為了克服這種局限性，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出三種方法，包括鋅指核酸酶（ZFN）、TAL效應(yīng)器核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)，通過(guò)在多種生物（包括植物）中誘導(dǎo)特定位置的DNA雙鏈斷裂，完成位點(diǎn)特異性誘變，這會(huì)刺激細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制，包括容易出錯(cuò)的非同源和末端連接（NHEJ）。
CRISPR/Cas DNA編輯系統(tǒng)，是開(kāi)發(fā)的一種用于基因組工程的新方法。它基于細(xì)菌對(duì)抗入侵DNA病毒和/或質(zhì)粒的II型CRISPR/Cas（CRISPR相關(guān)）免疫系統(tǒng)。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)利用整合到CRISPR位點(diǎn)的外源DNA片段，隨后通過(guò)轉(zhuǎn)錄加工成CRISPR RNAs（crRNAs）。反過(guò)來(lái)，crRNAs退火以反式激活crRNAs（tracrRNA）和并產(chǎn)生向?qū)NA（gRNA），指導(dǎo)序列特異性切割并通過(guò)Cas蛋白沉默外來(lái)入侵的DNA。在zui近開(kāi)發(fā)的CRISPR/Cas DNA編輯系統(tǒng)中，gRNA可以指導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9靶來(lái)誘導(dǎo)特異位點(diǎn)的精密切割。CRISPR/Cas系統(tǒng)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和整個(gè)生物體中實(shí)現(xiàn)基因敲除，如酵母、斑馬魚(yú)和線蟲(chóng)。后來(lái)，這種方法被迅速用于植物，在植物學(xué)研究中，它通過(guò)瞬態(tài)實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因植物繼續(xù)表現(xiàn)出其適用性。延伸閱讀：中國(guó)農(nóng)科院用CRISPR實(shí)現(xiàn)大豆基因組編輯。
CRISPR/Cas比ZFNs和TALENs更有利，因?yàn)樗恍枰粋€(gè)單一的Cas9核酸酶，可以通過(guò)設(shè)計(jì)gRNA而編程，以指導(dǎo)靶特異性切割，但它不需要精心設(shè)計(jì)以及耗時(shí)的單個(gè)DNA結(jié)合蛋白裝配。有研究證明，CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物中能夠通過(guò)瞬態(tài)實(shí)驗(yàn)或轉(zhuǎn)基因植物實(shí)現(xiàn)的基因編輯。在大多數(shù)情況下，Cas9與gRNAs是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化或物理手段傳遞到植物細(xì)胞的，如PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或愈傷組織的基因槍轉(zhuǎn)化。
雙生病毒DNA復(fù)制可以提高基因打靶頻率。zui近，據(jù)報(bào)道，煙草花葉病毒（TRV）——一種在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的RNA病毒，可以將gRNAs傳遞到轉(zhuǎn)基因的Cas9表達(dá)煙草中，以實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的基因組編輯，甚至可以在兩個(gè)后代植株中被檢測(cè)到。然而，在植物中還沒(méi)有基于DNA病毒的基因組編輯傳遞系統(tǒng)。
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白菜卷葉病毒（CaLCuV）是雙生病毒家族中的菜豆金黃花葉病毒屬，在細(xì)胞核中復(fù)制。它通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的基因組編碼七種蛋白。目前，科學(xué)家已將CaLCuV開(kāi)發(fā)為一種病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）和miRNA表達(dá)載體。CaLCuV可感染十字花科和茄科中的許多宿主，延伸了其在植物生物技術(shù)中的應(yīng)用。
病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）被廣泛應(yīng)用于植物基因功能研究。然而，VIGS只能下調(diào)基因表達(dá)，在不同發(fā)育階段其有效性有所差異。為了克服這些局限性，在這項(xiàng)研究中，研究人員利用一種DNA病毒，在植物中進(jìn)行系統(tǒng)的基因敲除。病毒介導(dǎo)的基因敲除將沒(méi)有這些局限性。
他們報(bào)道稱(chēng)，CaLCuV——一種雙生病毒，能夠在植物中傳遞gRNA和誘導(dǎo)系統(tǒng)性的基因突變。研究人員使用修改的CaLCuV載體完成了植物基因組編輯（VIGE），在表達(dá)Cas9的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)gRNAs。
DNA測(cè)序在未接種葉子中證實(shí)了內(nèi)源基因NbPDS3和NbIspH的VIGE，因?yàn)镃aLCuV可以系統(tǒng)地感染植物。此外，在新發(fā)育的葉片中，NbPDS3和NbIspH的VIGE，可引起光漂白表型。這些結(jié)果表明，雙生病毒為基礎(chǔ)的VIGE，可能是植物基因組編輯的一個(gè)強(qiáng)大工具。
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