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作者：顏景超1，湯水平2，彭燦 1,2，任國譜1,*

摘 要：目的：開發(fā)一種快速測定嬰兒配方乳粉中* 酯類含量的反相液相色譜法。方法：直接使用

二氯甲烷和甲醇體積比為2.5:1 的混合溶劑對樣品進(jìn)行提取，在30℃的條件下采用等度洗脫，流動(dòng)相采用體積比為

80:20 的甲醇- 三氯甲烷溶劑，流動(dòng)相流速1.0mL/min；色譜柱溫度30℃，檢測波長325nm。結(jié)果：*醋

酸酯和* 棕櫚酸酯的回收率分別為100.1% 和102.8%，多次測定結(jié)果的相對偏差分別為1.18% 和0.96%，檢

出限分別為3.1ng 和4.3ng。結(jié)論：本方法操作簡單、精密度、回收率和靈敏度高，適用于嬰幼兒配方乳粉中的

* 酯類的檢測。

關(guān)鍵詞：* 酯類；嬰兒配方乳粉；反相液相色譜

Rapid Determination of Retinyl Esters in Infant Formula MilkPowder by Reversed-Phase

High-performance Liquid Chromatography

YAN Jing-chao1，TANG Shui-ping2，PENG Can1,2，REN Guo-pu1,*

（1. College of Food Science and Engineering, Central SouthUniversity of Forestry and Technology, Changsha 410004, China；

2. Hunan Avadairy Co. Ltd., Changsha 410200, China）

Abstract ：Objective: To develop a rapid reversed-phase highperformance liquid chromatographic （RP-HPLC） method for

measuring retinyl esters in infant formula milk powder. Methods:Samples were directly extracted with a mixture of dichloromethane

and methanol （2.5:1, V/V）. The chromatographic separation wasperformed at 30 ℃ in the isocratic elution mode using a

phase composed of a mixture of methanol and chloroform （80:20,V/V）. Results: Retinyl acetate and retinyl palmitate presented

average spike recoveries of 6 replicates at 2 levels of 100.1%ａnd 102.8%, with relative standard deviations of 1.18% and 0.96%,

respectively. The detection limits for retinyl acetate ａndretinyl palmitate were 3.1 ng and 4.3 ng, respectively. Conclusion:The

method demonstrates simplicity and high precision, recovery ａndsensitivity, and thus has promising potential for practical

applications.

Key words：retinyl esters；infant formula milkpowder；reversed-phase high performance liquid chromatography

中圖分類號：TS252.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1002-6630（2010）08-0154-04

VA 是一種重要的*，其主要生理功能

是維持視覺和骨骼健康、參與細(xì)胞分裂和細(xì)胞識別、參與生長、生殖及維持免疫系統(tǒng)的完整性等[1]。GB 10766—1997《嬰兒配方乳粉Ⅱ、Ⅲ》和GB 10765 — 1997

《嬰兒配方乳粉Ⅰ》中規(guī)定嬰兒配方乳粉中VA 的含量

為1250～2500IU/100g，其允許添加使用的種類中包括* 醋酸酯和* 棕櫚酸酯[2]。目前測定嬰兒配

方乳粉中的VA多采用液相色譜法[3-9]，分析之前一般需對樣品進(jìn)行皂化處理[3-7]，其過程溶劑消耗量大、操作繁瑣且不能測出*酯類的含量。本實(shí)驗(yàn)采用反相色譜法定嬰兒配方乳粉中* 酯類，前處理不經(jīng)皂化，直接使用二氯甲烷和甲醇混合劑沉淀蛋白并提取*酯類，能快速檢出* 醋酸酯和* 棕櫚酸酯的含量，為生產(chǎn)過程中的維生素的控制和風(fēng)

※分析檢測食品科學(xué)2010, Vol. 31, No. 08 155

險(xiǎn)評估體系的建立提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

嬰兒配方乳粉1 段（0～6 月嬰兒食用） 市售。甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷（均為色譜純） 美國edia 公司；NaCl（分析純）南京化學(xué)試劑有限公司；* 醋酸酯、* 棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma 公司。

Waters alliance 2695 液相色譜系統(tǒng)（配有1200 型，安捷倫公司紫外檢測器，Empower控制軟件）；UV-1800 紫外- 分光光度計(jì)日本島津公司；BF2000 型氮吹儀；800B低速臺

式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TC-C18 柱（4.6mm ×25cm，5μm） 美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

* 醋酸酯和* 棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別準(zhǔn)確稱取10mg 的* 醋酸酯或*棕櫚酸酯，用甲醇定容于100mL 容量瓶中，制備成質(zhì)量濃度為100μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。* 醋酸酯和*棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別取1mL * 醋酸酯或* 棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，制備成質(zhì)量濃度為2μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.25g 樣品于10mL 離心管中，加入1mL 溫水充分溶解，加入7mL 體積比為2.5:1的二氯甲烷和甲醇混合溶劑對樣品進(jìn)行提取，旋渦振蕩5min，靜止5min后，加入1mL 飽和NaCl 溶液，反轉(zhuǎn)振蕩3次，2500r/min 離心5min。將二氯甲烷層在氮?dú)庀麓蹈?，用甲醇?/p>

解。通過0 . 2 2μm 的濾膜過濾，用棕色小瓶收集。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜測定

將* 醋酸酯和* 棕櫚酸酯的標(biāo)準(zhǔn)貯備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液在波長200～400nm 內(nèi)掃描，波長間隔1 nm。

1.2.4 色譜條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

因素為流動(dòng)相體積配比、柱溫、流動(dòng)相流速。本試驗(yàn)不考慮交互作用，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行分析，有一個(gè)空列，可以作為實(shí)驗(yàn)誤差以衡量試驗(yàn)的可靠性，因素水平見表1。

1.2.5 定量分析

采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

分別配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定，得到相應(yīng)的峰面積。以標(biāo)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

因素

水平A 流動(dòng)相體積配比B 色譜柱柱C 流動(dòng)相流（甲醇:三氯甲烷） 溫/℃ 速/（mL/min）

1 100:1 30 1.0

2 90:10 40 0.8

3 80:20 50 0.6

表1 正交試驗(yàn)因素水平

Table 1 Factors and levels in orthogonal array designforoptimizing instrumental parameters for HPLCanalysis結(jié)果表明，測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線在標(biāo)樣質(zhì)量濃度1～5μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，* 醋酸酯和*棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程分別為y ＝ 1 6 2 0 0 4 x －6012.6 和y=99332x － 2628.1，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9992和0.9991。

2.2 *色譜條件的選擇

2.2.1 *檢測波長的選擇

從圖2 可以看出，* 醋酸酯和*棕櫚酸酯在此波長范圍內(nèi)均有兩個(gè)特征吸收峰，依次分別為263、326nm和260、324nm，其中兩種物質(zhì)zui大吸收峰均在波長325nm 左右，所以*測圖1 * 醋酸酯和* 棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.1 Standard curves of retinyl acetate and palmitate

900

800

700

600

500

400

300

200

100

0

y=162004x － 6012.6

R2=0.9992

峰面積/（mV·s）

標(biāo)樣質(zhì)量濃度/（μg/mL）

0 1 2 3 4 5 6

y=99332x － 2628.1

R2=0.9991

* 醋酸酯* 棕櫚酸酯

圖2 * 醋酸酯和* 棕櫚酸酯的紫外吸收光譜

Fig.2 UV absorption spectra of retinyl acetate and retinyl

palmitate standards

2.0

1.5

1.0

0.5

0

260nm

吸光度

波長/nm

200 250 300 350 400

－ 0.2

263nm

2

2

1

326nm

324nm * 醋酸酯

*棕桐酸酯

1

影響嬰兒配方乳粉中* 酯類檢測的主要色譜156 2010, Vol. 31, No. 08食品科學(xué)※分析檢測定波長為325nm。

2.2.2 色譜條件的影響

2.2.2.1 流動(dòng)相配比的影響

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用甲醇作為流動(dòng)相，*棕櫚酸酯的保留時(shí)間都超過40min，不適合日?？焖俜治?。采用甲醇與三氯甲烷不同的體積配比進(jìn)行檢測，當(dāng)甲醇與三氯甲烷的體積比為80:20時(shí)，* 酯類的分離度較好，保留時(shí)間也較短，15min內(nèi)完成分析。三氯甲烷過多流動(dòng)性極性過小，保留時(shí)間過短不適合作為反相流動(dòng)相，因此依據(jù)液相分析經(jīng)驗(yàn)在正交試驗(yàn)中選擇甲醇與三氯甲烷的體積比范圍為100:1、90:10、80:20。

2.2.2.2 流動(dòng)相流速的影響

當(dāng)流動(dòng)相流速減少時(shí)，色譜峰的分離效果稍好，但是* 酯類的保留時(shí)間延長，而且峰寬有所增加，峰高降低，*酯類檢測的靈敏度降低。在液相測定過程中，流速一般設(shè)為1mL/min左右，流速過大會導(dǎo)致系統(tǒng)壓力過大；流速過小，導(dǎo)致保留時(shí)間過長，且峰變寬，靈敏度降低，因此在正交試驗(yàn)中流動(dòng)相流速水平選擇1.0、0.8、0.6mL/min。

2.2.2.3 色譜柱溫度的影響

通過30、40、50℃ 3個(gè)色譜柱溫度試驗(yàn)，表明色譜柱溫度對樣品分離效果影響不大，只是對保留時(shí)間稍有影響；低溫30℃比高溫50℃時(shí)稍長，基本不影響峰高或峰面積，但是溫度高流動(dòng)相容易產(chǎn)生氣泡。因此在正交試驗(yàn)選擇色譜柱溫度的范圍為30～50℃。

2.2.3 色譜條件正交試驗(yàn)結(jié)果

圖3 標(biāo)準(zhǔn)樣和樣品的色譜圖

Fig.3 HPLC chromatograms of mixed retinyl acetate and retinylplamitate standards and a sample （both at a mixing ratio of 1:1）

試驗(yàn)號

A 流動(dòng)相體積配B 色譜柱空列C 流動(dòng)相流

綜合得分

比（甲醇:三氯甲烷） 柱溫/℃ 速/（mL/min）

1 1（100:1） 1（50） 1 1（1） 67

2 1 2（40） 2 2（0.8） 65

3 1 3（30） 3 3（0.6） 61

4 2（90:10） 1 2 3 77

5 2 2 3 1 85

6 2 3 1 2 84

7 3（80:20） 1 3 2 92

8 3 2 1 3 87

9 3 3 2 1 95

k1 64.3 78.7 79.3 82.3 總分 713

k2 82 79 79 77

k3 91 80 77.7 75

R 26.7 1.3 1.6 7.3

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Arrangement of experimental results of orthogonal array

design for optimizing instrumental parameters for HPLC analysis

采用L9（34）正交試驗(yàn)，探討流動(dòng)相體積配比、流動(dòng)相流速、色譜柱溫度對* 酯類測定的影響，從保留時(shí)間、峰型、系統(tǒng)壓力3個(gè)方面通過綜合評分來判斷方法優(yōu)劣。滿分100 分，其中保留時(shí)間占50 分（3min計(jì)50 分，53min 計(jì)0 分），峰型占40分（每種色譜條件基礎(chǔ)分25，峰不前伸加3 分，不拖尾加3 分，然后按峰型好壞一次加9 到1 分），系統(tǒng)壓力10分（壓力1000～1500psi 計(jì)10 分，1500～2000psi 計(jì)6 分，超過2000psi計(jì)2 分） 。結(jié)果見表2 。

使用極差分析法分析數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，流動(dòng)相配比對* 酯類測定的影響zui大，其影響順序是A 流動(dòng)相體積配比＞ C 流動(dòng)相流速＞B 色譜柱溫度。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外吸收光譜結(jié)果，確定*色譜條件為：流動(dòng)相體積配比為80:20 的甲醇-三氯甲烷溶液，色譜柱溫度30℃，流動(dòng)相流速1.0mL/min，測定波長325nm。

根據(jù)以上確定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)對* 酯類標(biāo)準(zhǔn)品和

樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3 。

由圖3 可以看出，* 酯類保留時(shí)間短，* 醋酸酯大約為5min，*棕櫚酸酯大約為10min，色譜峰附近不存在干擾物質(zhì)，和其他成分分離效果良好。樣品與標(biāo)準(zhǔn)峰形及出峰時(shí)間相吻合。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

0.032

0.024

0.016

0.008

0

4.793

AU

時(shí)間/min

0 3 6 9 12 15 9.893

a.標(biāo)準(zhǔn)樣（兩種標(biāo)準(zhǔn)液按1:1 混合后進(jìn)樣）

0.0100

0.0075

0.0050

0.0025

0

4.668

AU

時(shí)間/min

0 3 6 9 12 15

9.893

b.樣品（兩種樣品zui終提取液按1:1 混合后進(jìn)樣）

實(shí)驗(yàn)號

* 醋酸酯 * 棕櫚酸酯

測定值/（IU/100g） 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/% 測定值/（IU/100g） 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%

1 1942.43 1773.19

2 1937.19 1765.00

3 1987.82 1.18 1731.69 0.96

4 1963.38 1757.90

5 1931.95 1771.55

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

Table 3 Repeatability test for the method （n=5）※分析檢測食品科學(xué)2010,Vol. 31, No. 08 157

按上述方法同一天內(nèi)對市售嬰兒配方1 段乳粉樣品進(jìn)行5次重復(fù)測定，結(jié)果以*當(dāng)量計(jì)。結(jié)果見表3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，該法重復(fù)性好，* 醋酸酯和*棕櫚酸酯的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.18% 和0.96%。

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在已知* 酯類含量的奶粉中加入標(biāo)樣，樣品按上述方法處理后測定，結(jié)果以*當(dāng)量計(jì)，結(jié)果

見表4 。

物質(zhì)本底值/（IU/100g） 添加量/（IU/100g） 測定值/（IU/100g） 回收率/%平均回收率/%393299.5

2000 3794 96.0

*醋酸酯1952 3972 100.5 100.1

6012 101.0

4000 6190 104.0

5910 99.3

3835 102.0

2000 3733 99.3

*棕櫚酸酯1760 3812 101.4 102.8

6100 105.9

4000 5979 103.8

6002 104.2

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

Table 4 Spike recovery test for the method （n=6）

選擇兩種添加水平，按上述方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明該法回收率高，6 次測定* 醋酸酯和*棕櫚酸酯的平均回收率分別為100.1% 和102.8%。

2.5 zui低檢出限

按實(shí)驗(yàn)選定的色譜條件，以3 倍信噪比（RSN）計(jì)算出* 醋酸酯和* 棕櫚酸酯的zui低檢出限分別為3.1ng和4.3ng。

3 結(jié) 論

通過正交試驗(yàn)確定了測定* 酯類的*色譜條件：流動(dòng)相采用體積比為80:20 的甲醇-三氯甲烷溶劑，流動(dòng)相流速1.0mL/min，色譜柱溫度30℃，檢測波長325nm。加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加標(biāo)平均回收率為100.1%和102.8%（n=6）。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對偏差分別為1.18% 和0.96%（n=5）。檢出限分別為3.1ng 和4 . 3 ng 。本法樣品前處理簡單，測定準(zhǔn)確性和精密度高，適用于嬰幼兒配方乳粉中* 酯類的定量分析，也適合于其他同類產(chǎn)品*酯類的測定。

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