目的：建立生物樣品中甲氨喋呤（MTX）濃度測定方法。方法：固相萃取裝置和富集樣品，液相色譜法測定血清和腦脊液中MTX含量。色譜條件：以C18柱為分析柱，流動相為甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（2 ∶7∶91），流速0.8 mL.min-1，柱溫25 ℃，檢測波長313 nm。結(jié)果：在0.05～80 μg.mL-1范圍內(nèi)呈線性，回收率為90%以上， 血清中MTXzui低檢測限為10 ng.mL-1，腦脊液中zui低檢測限為5 ng.mL-1。結(jié)論：本法簡便、快速、靈敏度高、特異性強，適合于生物樣品中MTX監(jiān)測 及藥物動力學(xué)研究。
關(guān)鍵詞 固相萃取 液相色譜 甲氨喋呤 急性淋巴細(xì)胞白血病
監(jiān)測體液中甲氨喋呤（methotrexate,MTX）濃度，指導(dǎo)其對抗藥亞四氫*（folinic aci d,CF）的合理使用，是兒童急性淋巴細(xì)胞白血病MTX/CF大劑量療法中*的必要措施。生物樣品中MTX的測定方法有熒光分光光度法［1，2］、酶抑法［3］、放免法［4］和微生物法［1，5，6］，但都存在專屬性差等缺陷，MTX代謝物和*同類物干擾測定，因而結(jié)果的準(zhǔn)確性差?，F(xiàn)在大多采用熒光偏振免疫法測定，但其特異性差，而且試劑盒依賴進(jìn)口，價格昂貴，其監(jiān)測很難與臨床治療同步。液相色譜法能對MTX和代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和測定，因而其特異性和準(zhǔn)確性優(yōu)于上述方法。液相色譜法測定生物樣品（血清和腦脊液等）中MTX，主要受樣品預(yù)處理方法的限制，文獻(xiàn)報道的預(yù)處理方法有離子對 萃取［6，7］、采用Seppak小柱處理［8］、乙腈和甲醇去蛋白后直接進(jìn)樣 ［9］等方法，但回收率均介于38%～63%之間，且極不穩(wěn)定；為了提高靈敏度 ，進(jìn)樣量均為100 μL，由于雜質(zhì)去除不*，導(dǎo)致色譜柱嚴(yán)重污染，限制了該方法的使用。我們通過反復(fù)摸索，采用固相萃取凈化和富集樣品，反相液相色譜法測定血清及腦脊液中MTX，回收率達(dá)90%以上且非常穩(wěn)定，方法簡便、快速、特異性高、專屬性強、靈敏度高，* 能滿足臨床監(jiān)測及藥物動力學(xué)研究的需要。
1 儀器與材料
HP1100系列液相色譜儀（美國惠普公司）；DL-1型固相萃取器、Spe柱（*大連化學(xué)物理研究所）；WH-1型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）；MTX對照品（0138-9702，定量分析用，中國藥品生物制品檢定所）；甲醇和乙腈均為色譜純，水為重蒸餾水；0.9%氯化鈉注 射液（本制劑室生產(chǎn)），其它試劑為分析純。
2 實驗方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜柱為ODS Hypersil（5 μm,250 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-乙腈-7%*和1%枸櫞酸緩沖液（2∶7∶91，），流速0.8 mL.min-1 ，柱溫：25 ℃，檢測波長：313nm，進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖見圖1。血清及腦脊液中內(nèi)源性雜質(zhì)對MTX檢測無干擾，MTX及其代謝產(chǎn)物均達(dá)到基線分離，保留時間分別為14.3 min和 15.4 min ，色譜分析在18min內(nèi)完成。
圖1 4.33 μg.mL-1 MTX 對照品溶液（A）和ALL患兒
用MTX（3 g.m-2 iv）24 h時血清（B）及
2.5 h時腦脊液（C）的色譜圖
1.MTX 2.MTX代謝物
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取于100 ℃減壓干燥至恒重的MTX對照品5 0 mg,置50mL量瓶中，用甲醇定容，再以50%甲醇制成0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5 .0，10，20，40，80μg.mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取20 μL進(jìn)樣測定，以濃度（C） 對峰面積（A）進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：
A=44.87C+2.01 r=0.999 9
結(jié)果表明MTX在0.05～80 μg.mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
