摘要：作者開發(fā)了一種方法來比較各種C-18液相色譜柱及C-8液相色譜柱，此方法是基于各種液相色譜柱對極性和非極性化合物的保留時(shí)間、對稱性及選擇性的差異。這個(gè)用于比較各種色譜柱的實(shí)驗(yàn)既反映了鍵合相的疏水性，又反映了硅烷基質(zhì)的活性。作者收集了色譜柱的保留時(shí)間數(shù)據(jù)并列成圖表，以供選擇替換柱和后備柱時(shí)使用。
C-18和C-8硅烷液相色譜柱是液相色譜儀（HPLC）中zui常使用的色譜柱，而且，在美國市場上有多于100種C-18和C-8色譜柱出售。面對這么多可供選擇的色譜柱，分析工作者很難從中選出適當(dāng)?shù)纳V柱來具體使用，同時(shí)更難選擇出一根合適的替換柱。
對于非極性樣品（如小分子芳烴）或弱極性樣品（如對羥基苯甲酸酯），C-18和C-8色譜柱是zui容易選擇的。對于這類樣品，色譜柱之間的主要差異在于保留因子（k）；而在選擇性方面卻只有微小的差異。但對于極性和中等極性樣品色譜柱的選擇卻相當(dāng)困難。例如含氨基或酸性基團(tuán)的藥物化合物。分析工作者會(huì)發(fā)現(xiàn)極性樣品在保留時(shí)間、選擇性和峰形都有很大的差別。
色譜柱的選擇性和峰形受到擔(dān)體硅膠的影響遠(yuǎn)大于鍵合相的影響。另外，有研究報(bào)道在反相色譜中表面硅烷醇、硅酸及金屬雜質(zhì)的影響。在特殊情況下，選擇性的差異可由填料制備時(shí)使用的鍵合過程決定的。
通常情況下，色譜工作者選擇HPLC色譜柱是通過比較由色譜柱供應(yīng)商所提供的填料介質(zhì)的規(guī)格來決定的。這些規(guī)格內(nèi)容包括：表面積、末端封尾、含碳量、顆粒形狀、顆粒尺寸、孔徑、孔容積、裝填密度和鍵合度。含碳量和鍵合度僅由色譜制造商提供，沒有這些規(guī)格使用者不可能計(jì)算出碳的克數(shù)，也不可能計(jì)算出一根色譜柱中鍵合相的微分子數(shù)。分析工作者可使用這兩個(gè)數(shù)據(jù)來估計(jì)一根色譜柱的疏水性質(zhì)。然而，即使制造商提供所有上述規(guī)格數(shù)據(jù)，使用者也不可能地預(yù)測出色譜柱對含有極性官能團(tuán)的化合物的選擇性。
由于色譜的保留時(shí)間是基于分析物和填充基質(zhì)之間許多微妙的相互作用，我們建議使用混合物測試來比較填充基質(zhì)的規(guī)格與性能。Engelhardt和他的同伴回顧了硅烷反相色譜的特性，并且提出用溶解物試驗(yàn)來描述固定相的疏水性和親硅基醇特性。另外有一些人也改進(jìn)了測試條件和方法來解釋那些色譜數(shù)據(jù)，但他們只測試了很少的商品色譜柱，并且在他們的測試混合物中沒有羧酸。在本文中，我們使用了一個(gè)含有羧酸的測試混合物來收集了86根C-18和C-8硅烷色譜柱（見表1）的數(shù)據(jù)。我們將測試結(jié)果詳細(xì)描述如下。表1：研究中所使用的色譜柱的生產(chǎn)商（略）。
在我們的比較中，我們使用了含有6種物質(zhì)的測試混合物，此6種物質(zhì)列于圖1。每一種物質(zhì)在測試混合物中都起特殊的作用。*是用于產(chǎn)生空體積。甲苯是測試色譜柱的疏水性。吡啶和N，N-二甲基苯胺是用來測試硅醇基對堿性物質(zhì)的活性的堿性胺類物質(zhì)。*是一種弱酸，用于與吡啶聯(lián)合起來確定活性擔(dān)體硅的數(shù)量。4-正丁基苯甲酸是一種用于測試硅醇基對酸性物質(zhì)的活性羧酸，此方面是色譜柱制造者開發(fā)堿性去活色譜柱來作胺類物質(zhì)分析時(shí)經(jīng)常忽略的。
我們使用的流動(dòng)相是含有65%的乙腈和35%的濃度為0.05M的磷酸鉀混合溶液，pH值為3.2。pH=3.2的緩沖溶液可使4-正丁基苯甲酸質(zhì)子化，同時(shí)可提高吡啶和N，N-二甲基苯胺的保留時(shí)間的重現(xiàn)性。我們發(fā)現(xiàn)使用沒有加緩沖溶液的流動(dòng)相，如65%乙腈和35%水，即使我們使用同一瓶流動(dòng)相，也無法得到重現(xiàn)性較好的保留時(shí)間和峰形。高離子強(qiáng)度的緩沖溶液，如本次測試所使用的0.05M的緩沖溶液，會(huì)抑制一些硅醇基的活性（2，5），但對于將胺從一些非堿性去活的反相色譜柱中洗脫下來，有一些抑制作用是必要的。
我們測試過另外兩種緩沖溶液，但它們的作用均少于pH=3.2的0.05M磷酸鉀溶液。0.01M磷酸鉀緩沖溶液在pH=3.2時(shí)，胺類化合物在有些色譜柱中產(chǎn)生前移峰。0.05M磷酸鉀緩沖溶液在pH=7時(shí)，胺類物質(zhì)產(chǎn)生的峰形比在pH=3.2時(shí)更好。吡啶和N，N-二甲基苯胺的pKa均大約為5.2；因此，這些組分在pH=7時(shí)未質(zhì)子化并且呈中性，同時(shí)并不與強(qiáng)酸性的硅醇基發(fā)生離子交換作用。
實(shí)驗(yàn)部分
配制0.05M的磷酸鉀緩沖溶液， 將6.8g的磷酸二氫鉀加入1LHPLC級的水中。加入濃磷酸直至pH=3.15-3.2（控制緩沖溶液的pH值在此范圍是非常重要的，因?yàn)檫拎ず蚇，N-二甲基苯胺對pH值非常敏感），用650ml乙腈和350ml緩沖溶液混合來配制流動(dòng)相，此混合物經(jīng)孔徑為0.45um的過濾器過濾。為了檢測流動(dòng)相配制是否正確，我們將測試混合物注射入一根色譜柱與此混合物在另一批正在使用的流動(dòng)相中的保留因子作比較。
制備100ml測試混合物，先將65ml乙腈和4mg*，15mg吡啶，40mg*，15mgN，N-二甲基苯胺，30mg4-正丁烷苯甲酸及400mg甲苯混合，超聲波處理一會(huì)，然后加入35mlHPLC級的水，再超聲波處理直到所有固體溶解（將此測試混合物裝入2ml的瓶子，編號(hào)為1092，由AlltechAssociates 提供）。同時(shí)準(zhǔn)備各種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度與在測試混合物中的濃度相同。
流速為1.0ml/min，注射器容量為10ul，柱溫為19-22℃，使用紫外吸收檢測器，波長為254nm。關(guān)于色譜柱的直徑，除了Alltech 的alphaBond C-18和Waters的uBondapak C-18柱 （30cm×3.9mm）及Waters的Symmetry C-18和C-8柱 （15cm×3.9mm）之外，所有色譜柱均為15cm×4.6mm。
關(guān)于填料顆粒直徑，除了Altech 的Adsorbosphere XL ODS（3um）；Waters 的Nova-Pak C-18（4um）；Synchrom 的Synchropak RPP C-18,300（6.5um）和Waters的uBondapak C-18、Alltech的Versapack C-18、Alltech的alphaBond C-18 以及Whatman 的Partisil OPS 和Partidil ODS-2（全是10um）以外，其余所有色譜柱均為5um。顆粒的尺寸僅作為介紹而列出來，如果制造者在制備各種尺寸的顆粒時(shí)使用相同的硅基和鍵合過程，則顆粒的尺寸不影響保留時(shí)間、選擇性或峰形。
在比較中使用的色譜柱全是新的，不是剛填充填料的就是近來購買的。用多于20倍柱容積的流動(dòng)相來沖洗所有色譜柱，并且重復(fù)地注射測試混合物直到各組分的保留時(shí)間變化少于0.02min。
我們注射入標(biāo)樣來確定各組分的出峰順序并用所獲得的簡潔的色譜圖來計(jì)算拖尾因子。我們沒有使用柱加熱器來控制柱溫，但我們確保了實(shí)驗(yàn)的環(huán)境溫度波動(dòng)少于3℃，環(huán)境溫度變化引起的保留因子變化少于3%，這樣溫度的變化在這次比較中可忽略不計(jì)。
保留因子用k=（tr-t0）/t0來計(jì)算，式中tr是要檢測峰的保留時(shí)間，t0是*的死時(shí)間。計(jì)算拖尾因子（T）是使用美國藥典的公式T=W0.05/2f，式中W0.05是峰高5%處的峰寬，f是峰高5%處的峰的前沿邊緣到垂直的zui大半峰寬。
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