β-*（β-elemene）是從中藥溫莪術(shù)（C.wenyujin Chen.etC.Ling）根莖中提得的有效單體［1］，具有抗腫瘤作用［2］。國內(nèi)外未見對生物體液中β-*測定方法報道。我們建立了用氣相色譜法分離并測定生物樣品中β-*的方法，并用該法研究了本品在動物體內(nèi)的生理處置（待發(fā)表）。
1 材料與方法
1.1 藥品與試劑 β-*標準品，純度98.8 %，1 %β-*乳劑，批號940828，均由中國科技開發(fā)院醫(yī)藥科技開發(fā)所饋贈；正十三烷，色譜純，中科院大連化學物理研究所饋贈；乙醚：上海馬陸制藥廠，分析純；二硫化碳，沈陽化學試劑廠，分析純。
1.2 動物 Wistar 大鼠，♂，體重：（180±5） g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
1.3 儀器 Shimadzu GC-7AG型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器（FID），ChromatopacC-R2A型數(shù)據(jù)處理機；GCD—300B氫氣發(fā)生器（北京中國惠普分析技術(shù)研究所）。
1.4 色譜條件 毛細管色譜柱：不銹鋼柱（2.1m×3 mm），固定相：5 % SE—30/Gas Chrom Q 80～100目；柱溫：115 ℃，氣化室溫度210℃，檢測器：FID；氣體流速：高純N2 30 mL/min，H2 40 mL/min，Air 400mL/min；量程：10；衰減：23；紙速：2.5 mm/min，進樣量2 μL。
1.5 標準液配制 準確稱量β-*標準品50 mg，置于100 mL容量瓶內(nèi)，用二硫化碳定容至刻度，搖勻，即得0.05%β-*母液。準確量取β-*母液10 mL，置于50 mL容量瓶內(nèi)，用二硫化碳定容至刻度，搖勻，即得0.01%β-*工作液。母液及工作液密封，-4 ℃保存。
1.6 內(nèi)標液的配制 準確稱量正十三烷350 mg，置100 mL容量瓶內(nèi)，用二硫化碳定容至刻度，搖勻，得0.35%內(nèi)標母液。準確量取內(nèi)標母液10 mL，置50 mL容量瓶內(nèi)，用二硫化碳定容至刻度，搖勻，得0.07%內(nèi)標工作液。母液及工作液密封后，-4 ℃保存。
1.7 生物樣品制備 取大鼠血漿、糞勻漿（1∶20）、膽汁各1 mL，分別加入內(nèi)標工作液10 μL，飽和氯化鈉溶液3滴，0.1mol/L氫氧化鈉溶液200 μL，混勻后室溫下靜置5 min，乙醚提?。? mL×2），旋渦混合30s，離心（3000r/min,10min），合并乙醚提取液，35 ℃恒溫水浴下?lián)]干，殘留物用100 μL二硫化碳溶解，進樣2μL測定。
2 生物樣品標準曲線及回收率
取大鼠空白血漿、糞勻漿、膽汁各1 mL，分別置于玻璃離心試管內(nèi)，各加入內(nèi)標工作液10μL，β-*工作液2、4、6、10、20、40、80 μL，按上述生物樣品制備方法操作，冰浴下定容100 μL，進樣2μL。以β-*與內(nèi)標物峰面積比（As/Ai，Y）對β-*濃度（X）直線回歸，結(jié)果表明各生物樣品標準曲線均通過原點，在0.1～4.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由各生物樣品標準曲線各點峰面積與標準曲線對應點的峰面積比值計算回收率，各樣品的回收率在97.50%～99.16 %之間（表1）。
表1 生物樣品回歸方程及回收率（n＝3）
生物樣品
回歸方程
r
回收率
±S/%
血 漿
Y＝0.5240X+0.0123
0.9999
99.16±1.6
糞勻漿
Y＝0.5372X+0.0042
0.9998
98.64±4.6
膽 汁
Y＝0.5260X+0.0056
0.9998
97.50±3.4
3 精密度
配制不同濃度的β-*生物樣品，作日內(nèi)、日間精密度實驗。各生物樣品As/Ai的RSD均小于10 %（表2、3）。方法的zui低檢測限為2ng/2 μL（S/N=2），相當于0.1 μg/mL血漿。
表2 生物樣品日內(nèi)精密度（n＝5）
濃度/
（μg/mL）
RSD/%
血漿
糞勻漿
膽汁
0.1
8.39
8.24
8.73
1.0
3.99
5.72
4.24
4.0
2.60
3.14
2.07
4 方法特異性
大鼠iv β-*乳75mg/kg后，分別制備血漿、糞勻漿及膽汁樣品進行測定。結(jié)果表明，內(nèi)標物與β-*的tR分別為8.4、13.3min，與標準品一致，二者分離良好，且不受生物樣品中雜質(zhì)干擾，表明各生物樣品中的被測物即為β-*原形藥（圖1～3）。
表3 生物樣品日間精密度（n＝5）
濃度/
（μg/mL）
RSD/%
血漿
糞勻漿
膽汁
0.1
5.95
9.99
8.03
1.0
7.98
7.96
6.16
4.0
2.20
6.41
5.75
圖1 大鼠空白血漿（A）、空白血漿+內(nèi)標+β-*
標準品（B）、大鼠iv β-*后血漿（C）的色譜圖
1.內(nèi)標物 2.β-*
圖2 大鼠空白膽汁（A）、空白膽汁+內(nèi)標+β-*
標準品（B）、大鼠iv β-*后膽汁（C）的色譜圖
1.內(nèi)標物 2.β-* 3.未知物Ⅰ
圖3 大鼠空白糞勻漿（A）、空白糞勻漿+內(nèi)標+β-欖香
烯標準品（B）、大鼠iv β-*后糞勻漿（C）的色譜圖
1.內(nèi)標物 2.β-* 3.未知物Ⅱ 4.未知物Ⅲ
5 討論
本文在國內(nèi)外建立了用氣相色譜法分離并測定生物樣品中β-*的方法。實驗中曾選用乙醇、環(huán)己烷作定容劑，但均出現(xiàn)保留時間長，峰形寬大，拖尾嚴重而影響測定，后選用二硫化碳作為定容劑，響應值小，出峰快，峰形窄，避免了因溶劑峰過寬而影響測定，并縮短了測定時間，提高了靈敏度及工作效率。血漿樣品中加入飽和氯化鈉，可增加極性，減少乳化，提高回收率；加入氫氧化鈉則消除了血漿中易在氣相色譜中出峰的有機酸類雜質(zhì)，減少其對測定的干擾。該法簡便，靈敏，重現(xiàn)性及特異性強，能滿足動力學研究的需要（已用該法研究了β-*在動物體內(nèi)的藥代動力學及生理處置，待發(fā)表）。
參考文獻
1 郭永等.溫莪術(shù)揮發(fā)油中*的分離與鑒定.中藥通報，1983,8：31
2 傅乃武.β-*的抗腫瘤作用及藥理學研究.中藥通報，1984,9：35
