提要 采用液相色譜法對低分子量*（LMWH）分子量及其分布進行了測定。流動相選用2.84%的硫酸鈉溶液，采用紫外檢測器與示差折光檢測器串聯(lián)連接，紫外檢測波長234 nm，色譜柱為Protein-Pak Φ8 mm×300 mm。結果表明：所測三批LMWH的重均分子量分別為3 158 D,4 387D,4 226D；其中分子量小于8 000D的量分別為86.2%，89.4%，87.8%，符合英國藥典1993年增補版標準。
低分子量*是商品*經(jīng)化學解聚而得的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，臨床上主要用于術后深靜脈血栓、不穩(wěn)定性心絞痛及血液透析等。近年來，國內(nèi)外對低分子量肝素的劑型及臨床應用報道較多，但以HPLC法測定其分子量報道較少，現(xiàn)采用HPLC法對LMWH分子量及其分布進行測定。
1 實驗部分
1.1 儀器、藥品及試劑
液相色譜儀（Waters公司）。低分子量肝素標準品（HO190 000，進口，Mna為3 700）；供試品三批（色譜自制）；所用試劑均為色譜純。
1.2 方法［1］與結果
以Protein-Pak Φ8 mm×300mm為色譜柱，選用2.84%（w/v）硫酸鈉作流動相，柱溫40℃，示差折光檢測器進口與UV檢測器出口相連，紫外檢測波長為234nm。
精密稱取低分子量肝素標準品及供試品，按10 mg/ml的比例加流動相溶解；用流動相配制0.01mol/L的NaN3溶液。按以上條件進樣，進樣量10μl，用NaN3測得紫外檢測器與示差折光檢測器出峰時間有一定的間隔，其間隔時間為15 s．
根據(jù)標準品在RI曲線及UV234曲線下的面積計算r,r=ΣRI/ΣUV234［2］；圖譜上任一點的分子量Mi=Mna RIi/rUV234i（Mna為低分子量肝素標準品的數(shù)均分子量3700，RIi為此點的RI面積，UV234i為此點的UV234面積），則供試品的重均分子量Mw＝Σ（RIiMi）/ΣRIi。分子量分布按RI色譜圖下小于8 000D的RI面積占RI總面積的百分數(shù)，結果見表1。
Table 1 The molecular weight and its distribution results ofLMWH
Batch NO. mw Molecular wieght distribution
9707 3158D 86.2%
9702 4387D 89.4%
9703 4226D 87.8%
2 討論
低分子量肝素的生物活性與其分子量及分子量分布密切相關，隨著分子量的降低，其抗FⅡa活性下降，因此低分子量肝素的分子量及分布是產(chǎn)品質(zhì)量控制的關鍵指標。以往曾采用粘度法測定LMWH的分子量［3］，但此法不能考察其分子量的分布情況，實驗采用HPLC方法，快速準確地測定了LMWH的分子量及其分布。
由于示差折光檢測器與紫外檢測器串聯(lián)連接，因此由其產(chǎn)生的色譜圖之間有時間間隔，通過NaN3可準確測定二者的時間差，使所測數(shù)值更準確。另外，通過RI圖譜發(fā)現(xiàn)，鹽峰、溶劑峰與主峰保留時間較接近，如何使其影響更小是今后有待解決的問題。
