targetingsystems(targeting systems)DLAR-4

Cypridina-Renilla 熒光素酶的雙重檢測(cè)

描述：

基于單一溶液的雙熒光素酶檢測(cè)試劑：

節(jié)省篩選應(yīng)用的成本和時(shí)間

已開發(fā)出一組改進(jìn)的超靈敏分泌型熒光素酶報(bào)告基因，以分析同一組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的兩種不同啟動(dòng)子活性。這種方法還使人們能夠在不殺死細(xì)胞的情況下實(shí)時(shí)研究反應(yīng)，因?yàn)檫@三個(gè)報(bào)告基因是分泌的。Targeting Systems 提供了許多不同的細(xì)胞內(nèi)和分泌型雙熒光素酶檢測(cè)試劑。Cycpridina -Gaussia 螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)特別有吸引力，因?yàn)?Cypridina 螢光素酶和 Gaussia 螢光素酶在細(xì)胞內(nèi)和分泌部分都具有強(qiáng)大的活性，并且在使用該試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)都具有穩(wěn)定的生物發(fā)光信號(hào)。Renilla 熒光素酶生物發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性（圖 2）。

Cypridina (Vargula) 螢光素酶：來自海洋介形魚 Vargula Hilgendorfi 的 Cypridina 螢光素酶（以前稱為 Vargula 螢光素酶）是一種分泌型螢光素酶，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 460 nm。它是已知的最亮的熒光素酶之一，具有最高的轉(zhuǎn)化率。

高斯熒光素酶：Gaussia Luciferase 是一種來自海洋橈足類 Gaussia Princeps (1,2) 的熒光素酶。這種不需要 ATP 的熒光素酶在產(chǎn)生光的反應(yīng)中催化底物腔腸素的氧化，并且與其他發(fā)光報(bào)告基因相比具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，例如可分泌性和更亮的信號(hào)強(qiáng)度，以及出色的生物發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定性。大約 10% 在一小時(shí)內(nèi)衰減。從用表達(dá) GLuc 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中測(cè)得的發(fā)光與產(chǎn)生的酶量成正比，這反過來又反映了轉(zhuǎn)錄水平。或者，細(xì)胞裂解物可用于盡管大部分活性是分泌的，但 Gaussia 熒光素酶的高靈敏度也允許從細(xì)胞裂解物中進(jìn)行測(cè)量。

生物發(fā)光信號(hào)和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性

圖A



圖B

DLAR-4 targetingsystems  

圖2： 使用熒光素酶測(cè)定試劑在DLAR-4系統(tǒng)中的不同熒光素酶報(bào)告熒光素酶活性的動(dòng)力學(xué)：建立反應(yīng)以測(cè)量轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品中不同熒光素酶的熒光素酶活性的動(dòng)力學(xué)。使用 DLAR-4 熒光素酶測(cè)定試劑測(cè)定熒光素酶活性。圖 A：使用 DLAR-4 雙檢測(cè)系統(tǒng)的 VLAR 組件時(shí) Cypridina 熒光素酶生物發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性。圖 B：使用 GAR-2 試劑和穩(wěn)定劑時(shí) GLuc 生物發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性。該試劑適用于需要檢測(cè)大量樣品的 HTS 應(yīng)用。在沒有穩(wěn)定劑的情況下，信號(hào)強(qiáng)度最初略高，但比有穩(wěn)定劑時(shí)衰減得更快。注意：顯示的數(shù)據(jù)是在 Turner TD2020 光度計(jì)上測(cè)量的三次重復(fù)測(cè)定的平均值。

好處：

Cypridina Luciferase 和 Gaussia luciferas 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液和裂解物中都具有非常強(qiáng)的信號(hào)。因此可用作雙分泌型報(bào)告基因或雙胞內(nèi)報(bào)告基因。

天然 Cypridina (Vargula) 熒光素酶和 Gaussia 熒光素酶具有天然分泌信號(hào)，并且在表達(dá)后有效分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。檢測(cè)熒光素酶不需要細(xì)胞裂解

Cypridinaia 螢光素酶是已知最亮的螢光素酶之一，與常用的螢火蟲螢光素酶相比，它具有最高的轉(zhuǎn)換數(shù)和更高的生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，使其成為理想的轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因 (1)。

Gaussia 螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定劑成分在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)提供穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)，讓用戶有時(shí)間進(jìn)行高通量分析以及手動(dòng)交付的檢測(cè)。

分泌的 Cypridina luciferas 蛋白是穩(wěn)定的，并且在產(chǎn)光方面具有*的活性，因此可以進(jìn)行非常靈敏的檢測(cè) (1,2)。

含有 VLuc 和分泌型海腎熒光素酶（即轉(zhuǎn)染后的生長(zhǎng)培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物）的樣品可以在 -20°C 下長(zhǎng)期保存。

Cypridina-Gaussia Luciferase Dual Assay Reagent-DLAR-4

套件內(nèi)容：

100x 腔腸素

儲(chǔ)存于 -20°C

Gaussia 熒光素酶測(cè)定稀釋緩沖液 - 4°C 保存

Gaussia 熒光素酶測(cè)定 (GAR) 穩(wěn)定劑 - 4°C 保存

100x Cypridina Luciferin 底物 -儲(chǔ)存于 -80°C

Cypridina 底物稀釋緩沖液 - 4°C 保存

VLAR 緩沖液（Cypridina 熒光素酶檢測(cè)緩沖液）- 4°C 保存

Cypridina (Vargula) 熒光素酶檢測(cè)緩沖液 - 4°C 保存

協(xié)議：

細(xì)胞上清液檢測(cè)：

Gaussia 螢光素酶檢測(cè)

用所需量的 Gaussia 熒光素酶測(cè)定稀釋緩沖液將 100X 腔腸素稀釋至 1X（每次測(cè)定需要 50 ul 稀釋試劑）。

將 5-20 µl 含有 Gaussia 熒光素酶或 Cypridina 熒光素酶的樣品移入每個(gè)孔或光度計(jì)管中進(jìn)行檢測(cè)

向每個(gè)樣品中添加 8 ul GAR 穩(wěn)定劑（這是可選的，如果省略穩(wěn)定劑，則會(huì)獲得更高但不太穩(wěn)定的信號(hào)。

向每個(gè)樣品中加入 50 ul Gaussia 熒光素酶檢測(cè)試劑（按步驟 1 所述制備）?；旌暇鶆虿⒃诠舛扔?jì)中讀取。

Cypridina (Vargula) 熒光素酶測(cè)定

用 Cypridina (Vargula) 底物稀釋緩沖液將 10 µl Vargulin 底物稀釋至 1 ml。

將 5-20 µl 含有 Gaussia 熒光素酶或 Cypridina 熒光素酶的樣品移入每個(gè)孔或光度計(jì)管中進(jìn)行檢測(cè)

向每個(gè)樣品中加入 40 ul VLAR 檢測(cè)緩沖液。

將 20 ul 稀釋的 Cypridina 熒光素底物（Vargulin）按步驟 1 中所述制備，添加到每個(gè)樣品中?；旌暇鶆虿⒃诠舛扔?jì)中讀取。

細(xì)胞裂解物中螢光素酶活性的測(cè)定： GAR 或 VLAR 螢光素酶測(cè)定試劑也可用于測(cè)量預(yù)裂解細(xì)胞中的螢光素酶活性。注意：如果您需要測(cè)量細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性，請(qǐng)先使用 Targeting Systems 的細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞。（目錄號(hào) 5X CLR-01）

用水稀釋 5X CLR 緩沖液 1:5。

吸出細(xì)胞培養(yǎng)基并用無血清 DMEM 洗滌細(xì)胞兩次。

添加足夠的 1X 細(xì)胞裂解緩沖液以覆蓋細(xì)胞。添加足夠的裂解緩沖液以覆蓋 cell.s（96 孔為 50 ul，12 孔為 300 ul，6 孔培養(yǎng)皿為 800 ul，10 cm 培養(yǎng)皿為 3 ml

在定軌振蕩器（室溫）上以 400 rpm 的速度搖動(dòng) 20 分鐘。

將 5-20 µl 含有熒光素酶的樣品或細(xì)胞裂解物與 100 µl 熒光素酶檢測(cè)試劑盒 (TS-1) 混合，并立即在光度計(jì)中讀數(shù)。

所有測(cè)定試劑在測(cè)定時(shí)應(yīng)接近室溫。

參考：

Yamagishi, K.、Enomoto, T. 和 Ohmiya, Y. (2006) Anal。生物化學(xué)，354，15-21。

Wu, C.、Suzuki-Ogoh, C. 和 Ohmiya, Y. (2007) Biotechniques, 42, 290-292。

Elisa Michelini、Luca Cevenini、Laura Mezzanotte、Danielle Ablamsky、Tara Southworth、Bruce Branchini 和 Aldo Roda* (2007) 用于多重生物發(fā)光和高內(nèi)涵篩選的光譜解析基因技術(shù)。肛悶?；瘜W(xué)，10.1021/ac7016579 S0003-2700(70)01657-8

4) BR Branchini、TL Southworth、JP DeAngelis、A Roda 和 E Michelini (2006) 來自意大利螢火蟲 Luciola italica 的熒光素酶：分子克隆和表達(dá)。Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2006 年 10 月；145（2）：159-67。

4) BR Branchini、DM Ablamsky、MH Murtiashaw、L Uzasci、H Fraga 和 TL Southworth (2007) 用于生物發(fā)光報(bào)告基因應(yīng)用的耐熱紅光和綠光螢火蟲熒光素酶突變體。肛悶生物化學(xué)，2007 年 2 月：361(2)：253-62。