丙二醛(MDA)含量試劑盒說明書

測定意義：
氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸，生成過氧化脂質(zhì)；后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合
物，其中包括MDA。通過檢測MDA 的水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平。

測定原理：
MDA 與硫代酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，在532nm 有zui大吸收
峰，進(jìn)行比色后可估測樣品中過氧化脂質(zhì)的含量；同時測定600nm 下的吸光度，利用532nm
與600nm 下的吸光度的差值計(jì)算MDA 的含量。

需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、
研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配置：
提取液：液體100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體30mL×1 瓶，4℃保存；

注意事項(xiàng)：
臨用前注意試劑一是否*溶解，如未溶解，可以70℃-90℃加熱，并振蕩以促進(jìn)溶解。

MDA 提取：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
（104 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 提
取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30 次）；
8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，
加入1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：
1、吸取0.3mL 試劑一于1.5mL 離心管中，再加入0.1mL 樣本, 混勻。
2、95℃水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10000g，25℃，離心
10min。
3、吸取200μL 上清液于微量石英比色皿或96 孔板中，測定532nm 和600nm 處的吸光度，
記為A532 和A600，ΔA= A532-A600。
MDA 含量計(jì)算：
a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）中MDA 含量的計(jì)算：
MDA 含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣=25.8×ΔA
2、細(xì)菌、細(xì)胞或動物組織中MDA 含量計(jì)算
（1）按照蛋白濃度計(jì)算
MDA 含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 樣)=25.8× ΔA ÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
（2）按照樣品質(zhì)量計(jì)算
MDA 含量(nmol/g 鮮重)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)=25.8×ΔA ÷W
(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
MDA 含量(nmol/104)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)=0.0516×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積， 4×10-4 L；ε：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155×103 L / mol /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：
樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。
b.用96 孔板測定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）中MDA 含量的計(jì)算：
MDA 含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷V 樣=51.6×ΔA