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使用明膠酶譜試劑盒時要注意這幾點

時間:2024/9/19閱讀:224
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使用明膠酶譜試劑盒時要注意這幾點


基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒描述:基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解 細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過影響細(xì)胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組 織重塑等過程,并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的 MMP-2MMP-9 參與各種生理與病理過程,其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9  活性。Zymography  是一種廣為使用的、基  SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,其靈敏度可達(dá) 1 nM,高于 ELISA 方法 2,其  本原理和程序是:制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電 泳, 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng) Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染,形 成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色 而形成透 亮區(qū)域,從而能同時指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,可檢測少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性,檢 測靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行 50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測,如果小膠加樣孔為 10~15個,則總計可檢測 500~750 個樣品。

 基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp2/9)試劑盒適用: 檢測 MMP-2MMP-9 酶譜及活性(Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM)。

 組成與儲存 (50 assays)

1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, 20 oC;
2.10 × Substrate G, 50 ml, 20 oC;
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸餾水稀釋;

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時用蒸餾水稀釋;

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液, 4 oC。

 

檢測步驟:

1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠:推薦分離膠濃度為 8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化,并 90 oC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍,混勻后加入過硫酸銨和 TEMED,等待凝膠聚合。

2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染  Marker 即可。陽 性對照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體積混合,取 5-15µl 上樣。

3. 低電流恒流電泳,每一塊小膠電流為 20mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。

4. 洗滌凝膠:取出凝膠,去除濃縮膠,放入容器內(nèi).可先用適量蒸餾水沖洗凝膠,然后加入10ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。

5.  孵育:倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),室溫或 37oC 孵育 1~5 小時。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37oC 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低,應(yīng)延長孵育時間為 10 小時或 過一夜。

6.  顯色:倒掉 Buffer B,加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書)。凝膠的大部分區(qū)域被深染,在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透明條帶。

7. 條帶掃描:將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明,但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法:可用非透射光掃描,或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示,并盡量設(shè)置為黑色.MMP條帶則為白色,這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

 

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