F/P比值的測定方法

    F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為1~2。過高時，非特異性染色增強(qiáng)；過低時，熒光很弱，敏感性降低。

（1）蛋白質(zhì)定量  測定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。

（2）結(jié)合熒光素定量  先制作熒光素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即準(zhǔn)確稱取FITC 1mg，溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/L pH7.2 PBS稀釋到100ml，此時熒光素含量為10μg/ml。以此為原液，再倍比稀釋9個不同濃度的溶液，用分光光度計在490nm波長測定光密度值（OD），以光密度為縱坐標(biāo)，熒光素含量為橫座標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)圖。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長波方向位移約5nm，F(xiàn)ITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93-495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。

F/P比值的計算：

    F/P克分子比值=（FITC  g/ml）/（蛋白質(zhì)mg/ml）×（160000×103）/（390×106）=0.41×（FITC  g/ml）/（蛋白質(zhì)mg/ml）

    式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103，而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。

測定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下：

    RB200熒光抗體的克分子比值=[（RB200 g/ml×10-3）/580]/[（蛋白質(zhì)mg/ml）/160000（IgG）]

    TMRITC熒光抗體克分子量比值=A515nmOD/A280nmOD 或=重量比（g/g）×（160000/580）