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上海研生生化試劑有限公司

F/P比值的測定方法

時間:2015-8-28閱讀:2729
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F/P比值的測定方法

    F(熒光素)和P(抗體蛋白)的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量,一般要求F/P的克分子比值為1~2。過高時,非特異性染色增強;過低時,熒光很弱,敏感性降低。

(1)蛋白質(zhì)定量  測定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。

(2)結(jié)合熒光素定量  先制作熒光素定量標準曲線,即準確稱取FITC 1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中,再用0.01mol/L pH7.2 PBS稀釋到100ml,此時熒光素含量為10μg/ml。以此為原液,再倍比稀釋9個不同濃度的溶液,用分光光度計在490nm波長測定光密度值(OD),以光密度為縱坐標,熒光素含量為橫座標,作標準函數(shù)圖。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后,其吸收光譜峰值向長波方向位移約5nm,F(xiàn)ITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93-495nm,RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。

F/P比值的計算:

    F/P克分子比值=(FITC  g/ml)/(蛋白質(zhì)mg/ml)×(160000×103)/(390×106)=0.41×(FITC  g/ml)/(蛋白質(zhì)mg/ml)

    式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量,390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103,而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。

測定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下:

    RB200熒光抗體的克分子比值=[(RB200 g/ml×10-3)/580]/[(蛋白質(zhì)mg/ml)/160000(IgG)]

    TMRITC熒光抗體克分子量比值=A515nmOD/A280nmOD 或=重量比(g/g)×(160000/580)       

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