使用濃度對熒光PCR結果的影響：ELISA試劑盒
SYBR Green I 的使用濃度是影響實驗成功與否的關鍵因素，如果SYBR Green I的濃度不飽和會使熒光信號不能反應產物量的變化。而過高濃度則會抑制PCR反應，降低PCR反應效率。通常試劑盒會有比較現(xiàn)成的方案。提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對PCR反應的抑制作用。在用SYBR Green I進行熒光PCR反應時， 鎂離子濃度要比無SYBR Green I 的普通 PCR 反應要高(0.5-2mM)。
 
缺點：
然而雖然SYBR Green熒光染料可以用來監(jiān)測各種雙鏈DNA序列的擴增，靈活性高是它的優(yōu)點，但是正如一個硬幣有兩面，通用性高就意味著專一性低，由于熒光染料可以和任何雙鏈DNA結合，因此DNA引物二聚體(primer-dimers)或其它非特異擴增產物(spurious PCR)可以對定量結果產生干擾(導致低Ct值)，同時也降低了反應的專一性和可重復性---而這一點對于定量PCR分析十分重要。ELISA試劑盒
 
舍不得SYBR Green I的方便、通用、便宜的優(yōu)點，又希望提高其專一性，許多人做了不少嘗試：比如仔細的設計引物和純化模板、比如使用能分析產物熔解曲線的軟件可以解決引物二聚體的問題選擇，還有就是采用嚴格熱啟動的擴增酶減少非特異擴增、采用特定的緩沖系統(tǒng)減少引物二聚體和錯配形成、采用修飾堿基減少二級結構或者改變穩(wěn)定性、在Tm值以上進行熒光測定減少引物二聚體的影響等等。提高PCR的特異性已經是老大難問題了，對于貪圖方便、便宜的實驗新手來說不一定能考慮周全，這也就是為什么許多希望能通過在普通PCR基礎上摸索條件，自己完成定量PCR檢測的研究人員發(fā)現(xiàn)結果不理想的主要原因之一。因此，不少生物技術公司針對熒光染料特異性缺點使出了各家的法寶，提出了有建設性和有新意的解決方案也讓這個熒光檢測技術繼續(xù)煥發(fā)光彩。ELISA試劑盒