質(zhì)粒DNA的小量制備
細(xì)菌的收獲和裂解 收獲 堿裂解法 煮沸裂解 質(zhì)粒DNA小量制備的問題與對策
質(zhì)粒DNA的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法
（一）細(xì)菌的收獲和裂解
1．收獲 
1）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。ELISA試劑盒 
2）將 1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。 3）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。

2．堿裂解法 
1）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。 
溶液Ｉ 
50mmol/L葡萄糖 
25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 
10mmol/LEDTA(pH8.0) 
溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細(xì)菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。

2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。 
溶液Ⅱ 
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋） 
1%SDS 
蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面 均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。 
3）加 150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ 
溶液Ⅲ 
5mol/Ｌ乙酸鉀 
60ml 冰乙酸 
11.5ml 水 28.5ml 
所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。ELISA試劑盒 
蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后 將管置于冰上3－5分鐘。 
4）用微量離心機(jī)于4℃12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 
5）可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 ℃以12000g離心 2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不*酚：氯仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應(yīng)的 DNA。 
6）用2倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置2分鐘。 
7）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘。 
8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。 
9）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。

i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3或pUC），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3－5μg。 
ii．如果要通過限制酶切割反應(yīng)來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時(shí)。將剩余的DNA貯存于－20℃。 
iii.此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物：
3．煮沸裂解 
1）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。 
STET
0.1mol/L NaCL
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
5% Triton X-100 
2）加25μl新配制的*溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，*就不能有效發(fā)揮作用。 
3）將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。 
4）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。 
5）用無菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。 
6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。 
7）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。 
8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。 
9）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心2分鐘。 10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體（2－5）分鐘。 11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。 注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能*滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Mg 2+存在下溫育（V中用限制酶時(shí)）質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟9）之間增加一步，即用酚：氯仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問題。

（二）質(zhì)粒DNA小量制備的問題與對策
裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個(gè)問題： 
1）有些工作者進(jìn)行小量制備時(shí)，有時(shí)會發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化 DNA。 ELISA試劑盒
2）在十分偶然的情況下，個(gè)別小時(shí)制備物會出現(xiàn)無質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。