當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一方面由于細(xì)胞密度過大，細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物枯竭和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。因此需要將培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的這個過程稱為傳代(passage)或者再培養(yǎng)(subculture)。

1)傳代標(biāo)準(zhǔn)

    傳代時間一般通過兩個方面進(jìn)行確定：一是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，當(dāng)培養(yǎng)液由于pH值下降面呈現(xiàn)黃色時，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到zui大密度，需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)；二是觀察細(xì)胞形態(tài)，健隸細(xì)胞形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。初代培養(yǎng)的傳代很重要，是建立細(xì)胞系的關(guān)鍵時期。在傳代時一般要特別注意以下3點(diǎn)：

①細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面之前，不要急于傳代。

②原代培養(yǎng)時細(xì)胞多為混雜生長，上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存的情況很常見。傳代時不同的細(xì)胞有不同的消化時間，因此要根據(jù)需要，注意觀察及時進(jìn)行處理，并可根據(jù)不同細(xì)胞對*的耐受時間不同而分離和純化所需要的細(xì)胞。另外早期傳代的培養(yǎng)細(xì)胞較已經(jīng)建系的培養(yǎng)消化時間相對較長。吹打細(xì)胞時動作要輕巧，盡可能減少對細(xì)胞的損傷。

③傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境有利于細(xì)胞生存和增殖。隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳人新的培養(yǎng)瓶。

    體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂的傳“代”概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞”與“子代細(xì)胞”中“代”的概念。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分離后再次培養(yǎng)，進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳代數(shù)可以衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。

    傳代是細(xì)胞分裂造成的結(jié)果，細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個細(xì)胞周期，分為間期與分裂期兩個階段。細(xì)胞周期能準(zhǔn)確表示細(xì)胞增殖速度。兩次細(xì)胞分裂之間的時間也可以用細(xì)胞世代時間來表示，所以細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間。正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。

    傳代代數(shù)與細(xì)胞的世代數(shù)(增殖代數(shù))并不是同一個概念。在細(xì)胞培養(yǎng)時，所說的“第6代細(xì)胞”指細(xì)胞已經(jīng)傳代6次。以貼壁細(xì)胞為例，每傳代一次，大概要倍增3．6次，細(xì)胞要經(jīng)歷如下生長過程：游離期、貼壁期、潛伏期、對數(shù)生長期和停止期(平臺期)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到平臺期時，就要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至死亡。

    培養(yǎng)細(xì)胞有密度依賴和接觸抑制的特點(diǎn)，細(xì)胞濃度過低，不易存活，表現(xiàn)為細(xì)胞在達(dá)到增長前有較長的滯留期；細(xì)胞濃度過高，發(fā)生接觸抑制后生長遲緩甚至死亡，所以傳代比例通常按l：2～1：4的稀釋度進(jìn)行。傳代后細(xì)胞的接種濃度一般為5×lO5個／mL。